用CRP评估心血管病的分析前和分析中变异

摘要

    背景。C反应性蛋白（CRP）广泛用于提示炎症，在动脉硬化中起重要作用。最近的前瞻性研究表明，健康者的CRP的参考区间内的升高也是心肌梗死，中风，心脏性促死和外周心血管病的强预示因素。根据现有的证据，美国心脏病学会和CDC已制定出应用CRP于冠心病的一级预防和稳定性心绞痛或急性冠脉综合征的导则，但优化此标志物用于危险性评估仍有许多工作要做。
    问题。大多数传统的CRP试验是用于提示急、慢性炎症，其敏感性不适于评估冠心病的危险性，需要高的敏感性。由于某个体的CRP浓度高低是依界限值制定的，因此相关的分析前和分析中的问题应予考虑，且应尽量地标准化以避免误判心血管病的危险性。
    结论。改进CRP的性能，结合了解CRP的生理变异可改善标准化，改进质量评价系统的性能，改善危险性的预示。
    1930年，Tillet和Francis观察到肺炎链球菌感染者血清与肺炎链球菌外的C多肽混合时出现沉淀物，而健康者血清中却无此种‘C反应’物。其后，Macleod和Avery明确此物为蛋白，取名‘急性期’蛋白，因其见于各种急性感染者。不久，Lofstrom指出在急、慢性炎症均可出现此种急性期反应（Acute phase Response,APR）。因此，CRP就成为非特异性炎症蛋白。它在进化过程中非常保守，功能和结构与‘活化石’鲎的血液淋巴中的蛋白同源。

结构

    CRP为五聚体蛋白，由五个相同亚单位非共价联接，每个亚单位含206氨基酸，计算的分子量为23017kDa；因此整个CRP的分子量约118000kDa，蛋白的排列类似另一个急性期蛋白，淀粉样蛋白P。CRP结构中含结晶样的钙结合环，一亚单位与另一亚单位的钙部位相连成五聚体结构。此种结构可与磷酸胆碱配体结合，并提供钙结合的构型变化的信息。

基因组

    CRP基因位于Ⅰ号染色体长臂，邻近炎症相关的淀粉样蛋白P和Fc受体的基因：CRP基因长2.5kb，编码206氨基酸残基，组成二个外显子，由一个内含子隔开。前端两个氨基酸由第一个外显子编码，其余的氨基酸均由第二个外显子编码。CRP基因型与血清中的浓度明显相关，一项家族性心脏病研究表明，遗传因素决定CRP浓度的35-40%。目前尚未发现先天性缺乏。

生理功能
   

    CRP在体内的功能尚未完全搞清。其基本功能为非特异性防御。在炎症和组织损伤反应下，CRP在细胞因子IL-6,IL-1β,TNFα的刺激下由肝细胞合成。在钙离子存在下CRP与许多细菌，真菌或寄生虫的多糖结合，还可以与磷酸酰胆碱，磷脂酸胆碱或核酸结合，还可与阴离子性鱼精蛋白，肝素发生非钙离子依赖性的结合。最近发现CRP可与各种脂结构结合，如脂质体，脂蛋白。与脂蛋白结合后通过聚集而进入LDL,VLDL。一旦结合，CRP就成为补体经典途径的强激活剂，可促进调理作用和对异物的吞噬作用。它是初始免疫反应最迅速，上升最快的急性期蛋白（半衰期19小时）。组织损伤24-48小时CRP可增高1000倍以上。

临床意义
   

    CRP曾主要用于检测和指示各种炎症和坏死过程的结局，评价治疗效果。轻度炎症和病毒感染一般可使CRP升高至10-50mg/l，而急性炎症和细菌感染使可达50-200mg/l，更严重的感染和外伤可高于200mg/l。作为炎症的敏感而特异的标志物，CRP浓度应结合患者的病情和以前的检验结果来解释。
    最近已明确，看来健康的男，女性的血清CRP浓度即使在参考区间之内也与将来的冠心病相关。基础CRP浓度在最高位数者，将来发生心肌梗死，缺血性中风，外周动脉病和心脏性促死者要比最低位数者高2-4倍。其他炎症标志物，如淀粉样蛋白P，IL-6,sICAM,P选择素等也有类似的相关，这加深了对动脉粥样硬化的血管生物学的理解。上世纪，对慢性炎症始动和促进动脉硬化有了更多了解。与冠心病的传统和新的标志物相比，CRP是将来患冠心病的最强的预示物。如果再结合总胆固醇，LDL-C，HDL-C，其预示能力更强。重要的是，在健康人群中评估心血管病的危险性要用高度敏感的CRP（hsCRP）测定法。最近的“妇女健康研究”结果不仅说明CRP在预示未来的冠心病事件中优于LDL-C，而且表明高CRP，低LDL-C的妇女比高LDL-C，低CRP妇女患冠心病的危险性大。CRP比任何浓度的LDL-C或Framingham的任何危险性积分都有预示作用。这说明它可以在被传统方法漏检的情况下检出更多的危险人群。联合研究还表明，有代谢综合征且CRP增高的妇女要比CRP低者患冠心病的危险性高一倍。
    已用阿斯匹林，他汀类药物等干预措施来减低CRP升高者将来发生冠心病的危险性。CRP升高对患ACS而未发生AMI者有预示作用，这提示CRP可能反映动脉斑块的脆弱和易于破裂。其他炎症标志物，如IL-6，淀粉样蛋白A也有类似作用。CRP对动脉硬化的确切作用尚未明确，但现有证据表明，它不是与全身或血管炎症无关的标志物，而是真正的杀手。CRP可激活补体，上调粘附因子的产生，促进吞噬细胞吞入LDL，刺激NO的产生和内皮细胞合成表达一氧化氮合酶，且增加纤溶酶原激活物的抑制物1（RAI-1）的表达和活性。
    在此基础上，CDC和美国心脏病学会（AHA）制定出将CRP用于冠心病一级预防和稳定性心绞痛或ACS的导则。此导则也包括对实验室的特殊要求，确定临床用的CRP界限值：CRP＜1mg/l为减低，1-3mg/l为一般均值，＞3mg/l为升高，具相对危险性。
    为使测定准确，需要了解分析前和分析中的变异。以下讨论CRP测定误差的各种来源，部分为CDC/AHA专家组所慎重制定的。

CRP测定的变异来源

    一、 种族和文化。以往的CRP测定很难测出〈5mg/l者，实验室常报告“低于检测限”。如今已普遍应用高敏CRP（hs-CRP），能测出CRP在正常人群种的分布。Ledue等发现两性人群的CRP分布的偏斜和峰态均非正态分布。近期美国和欧洲比较了未接受激素替代疗法的妇女和男性CRP浓度的分布，发现两性人群的CRP第50百分位数～1.5mg/l。国家健康和营养调查资料表明CRP的浓度分布在白种人，非洲美国人和墨西哥美国男人中有明显差别，但日本女性的CRP似较男性为低。地域的差异，印度人比欧洲人高17%，经过对中心性肥胖和胰岛素抵抗的校正后，此种差异不再明显。这些资料表明，在临床应用上现无性别和种族的分界值。
    二、 年龄和性别。大多数研究报告年龄（20-70岁）与血清CRP浓度无关，但至少有两项报告提出CRP随年龄增大而稍升高。尚不能肯定此种升高是单纯由于年龄，还是由于肥胖或亚临床炎症或季节的关系。一项对1577名妇女的研究表明随年龄增长而轻度升高。年龄在45-54，55-64，65-74和＞75岁者的CRP均值分别为1.31,1.89,1.99,1.52mg/l。
    三、 季节变异。此方面的资料有限。对一组26名老人在一年间每月检测一次，结果在冬季和夏季间有3.7mg/l的变化，此间无炎症出现。专门研究心血管病生物标志物的SEASON项目，却报告未有季节间恒定的变化。
    四、 个体内与个体间的变异。一项对19名健康者连续20周的测定结果为个体内变异63%，个体间变异76%。另一项研究报告，个体内变异42%，个体间变异92%，这种变异使人怀疑能否用少量人群参考值的第3，4，5位数来预示CHD。但另一项研究总结了CRP的生物变异，认为较大的个体内变异（平均30%）和组内变异为120%是可以接受的。他们提出应采多份标本来确定个体的CRP值的基线，一项研究主张每月测定三次来确定个体的稳定程度，且其间无感染发生。近期的两项独立研究在间隔3月时间分别测定CRP和总胆固醇，可使90%以上的个体归入正确的位数，或与之相邻。对此资料进一步分析，会使95%以上的人群归入正确的位数或按最近推荐的界限点只相差一个位数。对个体变异的担心仍然存在，CDC/AHA专家组指出间隔两周分别测定两个独立的（空腹和非空腹）CRP均值可用来评估冠心病的危险性。如CRP＞10mg/l，应在两周后复查以避免因无症状的炎症反应或亚临床感染而致的错判。
    五、 生活方式（锻炼，吸烟，肥胖，嗜酒，服用抗炎药物，接受激素治疗）。锻炼时CRP浓度的影响研究较少。一项对30名马拉松长跑者的观察发现剧烈运动可使CRP升高，均值由长跑前的1.1mg/l升为长跑后的4.0mg/l，且持续升高至长跑后24h（达22.7mg/l）。一项对722名男人的观察，CRP浓度与心肺功能健康程度负相关，经校正后表明，心肺功能差者的CRP浓度于最高位数。对40岁以上的3638名健康成人观察到经常体力锻炼者CRP浓度和白细胞数上升者的比例明显较低，此现象已经过排除几种可能因素。此研究者认为经常锻炼的抗炎作用可缓解CHD的危险性。
    许多研究报告了吸烟与CRP间的关系。一般是吸烟者的CRP升高，且与吸烟量有关。老年人的CRP浓度与一生中接触的烟量有关。戒烟并不能中止此种相关性，表明吸烟的伤害不能逆转。这些资料支持CRP主要与吸烟年限有关，而与戒烟年限无关。近期吸烟者比从未吸烟者的CRP浓度可升高一倍，戒烟后可减低，但戒烟后10年者与从未吸烟者相比，CRP仍然升高。医师健康和妇女健康两项研究均提出CRP升高对吸烟和非吸烟者都是将来发生心肌梗死的良好预示指标，赫尔辛基心脏病研究指出吸烟者，同时CRP又在最高位数者，其发生CHD的相对危险性为8.6；而吸烟者的CRP在最低位数的只为1.6。
    体重指数较大者有较高的CRP，此种CRP与肥胖间的关系是由于脂肪组织在体内持续释放IL-6有关。事实上，体内的IL-6的1/4是来自脂肪组织，它可调节脂肪细胞的葡萄糖，脂代谢和体重。10-11岁的儿童，脂肪决定着CRP浓度，肥胖者的值高于估量指数最高五位数的上限。在2-3岁健康儿童营养研究项目中，肥胖与空腹的胰岛浓度升高有关，随之与CRP浓度升高有关。多项研究明确指出，体重明显减低者可有CRP的降低。数种细胞因子，粘附因子也减低，表明整体的炎症状态减弱。
    初发心肌梗死的患者，饮酒与CRP浓度有关，经常饮酒者比从不饮酒CRP要高，但与戒酒者之间无浓度的差别。饮酒三周的17名患者，在戒酒后CRP均值由6mg/l降至4mg/l。最近，Albert等指出，适应饮酒者比从不饮酒或偶尔饮酒者的CRP还低，说明饮酒可部分由于抗炎机制而缓解CHD危险性。前瞻性研究表明，适度饮酒者IL-6，TNFα受体1和2比不饮酒者还低，进一步说明酒精的抗炎效用。
    尽管阿司匹林可减少（～60%）CRP升高的男人心肌梗死的发生率，但其对CRP效果不能确定。一项报告中，健康志愿者口服7天阿司匹林（325或81mg/日）后CRP浓度无变化。而另一报告观察稳定性心绞痛患者在服用21开阿司匹林（300mg/日）后CRP浓度明显减低。另一研究，观察57名健康成人分别服用81mg/日，每3天81mg和每3天325mg阿司匹林，共服用1月。结果使血栓烷β2明显减低。此药物对CRP的作用还需大量的长期服用的研究来明确。尚不知在采标本前是否该停用定期的或慢性抗炎药物。如需停用，应事先停用多长时间，还需恰当地研究。
    洛伐他汀和普伐他汀均有CRP升高者减少CHD事件的作用，说明此类药有抗炎作用，且经实验室研究确定。多项研究表明，普伐、洛伐、阿托伐，西姆伐和色伐他汀类可使CRP减低15-20%，且此种减低非剂量依赖性，也与LDL-C无关。据认为是由于药物介导的单核细胞表达IL-6和TNFα减少。
    随机和交叉研究均表明激素替代疗法可使CRP浓度升高2-3倍。在妇女健康研究中，接受激素替代疗法的妇女比未接受者和同龄男性的CRP升高一倍。对绝经后的妇女观察口服雌激素和droloxifen的效果，发现雌激素治疗可明显升高IL-6和CRP浓度，而使可溶性E选择素略减低。相反，droloxifen对CRP和IL-6均无影响，却可使E选择素略低。两者合用的促炎或抗炎作用尚未明确，需继续研究选择性雌激素替代疗法的作用最近的前瞻性研究观察到外源性雄激素对血清炎症标志物（包括CRP）没有作用。考虑到雌素对血清炎症标志物有作用，这可能是性别的差异。
    六、 其他。观察15名健康者由居住在海平面地域迁至海拔3600m后，血清CRP平均浓度升高65%，在评价居住高度对血液化学成分的影响时，应用高地域使血红蛋白增高的因素来校正。妊娠妇女较非妊娠妇女的CRP略高，但与育龄无关。
    七、标本 采集。
    （一）空腹。对空腹和餐后的CRP差别的比较资料较少。已证明脂肪食物会有影响。故用光学原理测定时，如浊度法或光散射法必须空腹采取标本。
    （二）采集时间。重要的是确定生理节律。刺激CRP合成的IL-6等促炎症因子有日内的变异。最近研究13名健康者的每小时的CRP，结果无变化。CRP相对较长的半衰期削弱了IL-6的作用。
    （三）标本类型。大多数的免疫分析用血或血浆均可，CRP也未因之出现差别。但EDTA或枸橼酸盐抗凝血浆与血清间有～12%至～16%的差异，其解释为抗凝剂使红细胞的渗透压发生了变化。应用Deming回归分析比较肝素抗凝血浆与血清的斜率为0.99，与EDTA抗凝全血间的斜率为0.90。一般地，全血比血清的结果低一个位数。但另有报告，对5名患者由同一穿刺采取的血清，肝素血浆，EDTA血浆间无差异。鉴于这种矛盾，CDC/AHA委员会提出，应对高敏CRP的血清和肝素或EDTA血浆进一步比较。
    （四）标本贮存的温度和时间。CRP在4℃可稳定60天。将健康者的标本贮于液氮中，经6月CRP无明显变化。一项长期贮存研究结果，将健康者和急性炎症患者的血清或血浆贮于-70℃，经20年无明显变化。欲长期贮存标本，最好是放入空气空间极小的冷冻管内贮于-20℃以下，复溶时应缓慢，倒转混合。

分析中的变异

    一、检测方法。血清或血浆的商品测定方法已有多种。过去曾用过胶乳凝集试验作半定量来判断炎症，但敏感性不够，使结果解释难与临床一致。70致80年代，更可靠的方法出现，如浊度法和光散射法。其优点是全自动化，快速，重复性好，但检测限只在5mg/L。用于CHD的危险性评估，必须能测出0.5~3.5mg/L的CRP。
    经用荧光、化学发光和放免法并增强抗体的沉淀性能和优化信号检测，已可定量健康人的CRP，且使更多实验室可用。经改进将聚苯乙烯（Latex）粒子与特异性抗体共价交联以增强光散射信号，此方法最得成功，因可用自动生化分析仪测浊度，故广为实验室采用。
    Hs-CRP应用的增多而更注意其性能和临床应用。应用不同分析方法可出现不同的结果，故需强调标准化。为临床需要，有时需用二种方法来测定，这肯定会造成临床和实验室的困惑。如今，有了第三代的Latex粒子的CRP试验，由于用了特殊的粒子，使测定浓度范围达0.1~200mg/L。
    二、检测限。为评估胆固醇的危险性，Hs-CRP测定的浓度应达最低界限值（1mg/L）。用于人群的测定，应低达0.15mg/L（参考人群的2.5位数）。有9种第二代Hs-CRP检测限可达≤0.3mg/L，5种达≤0.2mg/L，用于临床第二、三代Hs-CRP方法均有满意的灵敏度。
    三、精密度。多种变数，包括抗体的亲和力，标杯稀释（即形成的浊度）仪器状态（如灯光的衰减）和技术操作等造成的误差，用不精密度（CV）表示。一般的检验方法是对不同浓度的标本作多次重复测定。此方法可能需对2或3个超常值作处理。另一方法是用不同浓度的标本分别求不精密度。此法可提供可靠的试验有效范围，也可了解敏感度。对Hs-CRP来说，实验室的总不精密度应在线性范围内<10%，最近的调查在9种Hs-CRP方法中有5种符合此要求，余者尚需提高精密度。
    四、抗原过剩。在光散射分析中，抗原浓度如超过平衡点会形成小复合物，使散射减弱。CRP在疾病时浓度很高，测定中常有此现象。在9种CRP方法中有3种出现抗原过量现象，厂家必需克服这种缺陷，同时实验室应有能力查出和评估前带效应。
    五、基质效应。基质效应是由基质不同而出现了测定差异，如在血清和不同基质制备的标准物之间，此种差异还包括污浊度，蛋白结构（如单体和五聚体蛋白）及其他蛋白的结合。蛋白本身，抗体特异性和反应性的改变也会造成分析值的差异。将9种Hs-CRP方法用国际合格参考物（CRM470）溯源，对1份浓度为0.5mg/L的血清检测，发现有-31%至+28%的差异。作者认为各种校准物的基质效应是各方法间不一致的因素。
    六、曲线凝合方法。大多数Hs-CRP用常规的曲线凝合法，实验室应使凝合法有效以保证报造值无错误和偏移。有效的方法是测定标准来回算，且可发现浓度依赖性误差。用多浓度（多点）校准物比用单点或两点更准确和精密。对4种Hs-CRP评价，发现Roche，Technoclone和Biokit的方法与Babring II光散射仪法相比，在浓度~2.5mg/L时曲线有“弯曲”，造成反向的非线性。在2.5mg/L以上应用各自的回归方程可使4种方法测定患者的结果一致。但应强调，应对所有的试验仔细评价，尤其是在临床分界值处。

方法间的相关性

    方法间相关性研究两种方法的一致性。大多应用斜率和截距，最小平方回归和相关系数（r）。但此种方法均假设两方法均无误差，故会误导。应用Deming回归分析。可将两方法的误差减致最低。在解释时应注意，高的r值并不是指临床重要性的一致。最好用Bland-Altman法来解释相关资料，比较两方法的误差用百分数比绝对值好，因为SD常是浓度依赖性的。表6例举了此方法的优点，CDC大力开发用液相质谱法的CRP参考方法会对将来的试验评价提供准确性的基础。

参考物质
   

    1986年WHO第一代CRP免疫分析的国际参考制品（85/506）出现。1993年发布了CRM470，应用极精密的方法转移了85/506的值。虽然有了可靠的参考物，还有偏移相关问题和厂家转移值不佳的问题。另外，由于方法间的非通用性（如浊度法和光散射法），厂家没有将每个检测系统的校准物和质控物都与CRM470进行直接比较。
Hs-CRP试验的标准化
    上述的方法间的差异说明书需要标准化，每个患者的结果需用在全国确立的界限值来判定更需要方法间的一致。CDC已开始邀请全世界厂家均参加的标准化项目。第一期工作是确定适当的参考物。原有参考物的浓度较高（CRM470为39.3mg/L，WHO85/506为49mg/L）是用于传统方法的。最近的研究指出，用CRM470四个稀释品之一，可与厂家的标准品和混合血清稀释品相一致。IFCC介绍的数值转移法可成功的被运用。CRM470的优点是诊断试剂厂家可广泛用来作蛋白测定的校准品，它非常稳定，无干扰物（类风湿因子，脂类，单克隆蛋白等）且可大量提供，既能满足传统法，又能作高敏CRP的参考物，对诊断试剂厂家有明显的好处。最近CDC的Hs-CRP标准化委员会确定CRM470与其他后选的参考物有可比性，且用于第II期的工作。结合数值转移方法以使各种Hs-CRP试验达到一致。

质量评价方案

    大多数的室间质评项目都是由于传统的（非增强的）CRP试验。已发表的资料说明在制品内部和厂家间的大的误差均为浓度依赖性。2000~2001年的CRP质评说明，CRP浓度为28mg/L和56mg/L时，制品内的CV为12%，而浓度为2.9mg/L时为34%。最新资料表明，CRP<6mg/L时，不同制品间的CV由30%~60%，制品内（实验室间）竟高达160%；而CRP浓度>20mg/L时，分别为<20%和3~15%。比利时和英国以前的资料也与之相似。这说明需要更敏感的免疫分析法，也排除了用传统分析方法来估计CHD危险性。
    2000年CAP进行了Hs-CRP的质评调查，在不同方法间CRP浓度0.24mh/L时，CV为21~90%；浓度1.46mg/L时为6~23%；浓度11.3mg/L时为5~11%。准确性（参加者的所有方法平均值）在CRP浓度为0.24mg/L时为45%至215%；浓度1.46mg/L时为91%至116%；浓度11.3mg/L时为96%至114%。此种CV较大的结果进一步支持标准化的努力。

结论

    CRP虽已被发现70多年，但由于对临床意义了解不足和难以准确定量而停滞。随着CRP在健康人群中用CRP来预示冠脉事件并对急性冠脉综合症做予后使此试验得以更新。如今，已有了CRP导则用于CHD一级预防，稳定性心绞痛和急性冠脉综合症。更好地控制分析前和分析中变异无疑会改善CRP的测定。现有的Hs-CRP更为准确，但方法仍需标准化以改进准确性并使报告的结果一致。 

摘自：《医学仪器与试剂》