四、红细胞比积测定和红细胞平均指数的计算
（一）红细胞比积（hematocrit,Hct）测定
[原理] 将EDTAK2抗凝血在一定条件下离心沉淀，由引而测出其红细胞在全积压中所占体积的百分比，称为红细胞比积测定。红细胞比积的多少主要与红细胞数量及其大小有关，红细胞比积测定常用来诊断贫血并判断其严重程度，结合有关指数变化还可推断贫血病因，从而给恰当的治疗。红细胞比积测定对于相对性或绝对性红细胞增多症的诊断及治疗观察也有重要参考价值。
[方法学评价] 测定红细胞比积方法有多种，如折射计法、沾度法、比重测定法、离心法、电阻抗法和放射击性核素法。后者被ICSH定为参考法，非一般实验室所能开展。血细胞分析仪用微量血即可将红细胞比积与其它血细胞指标同时找印出来。离心测定红细胞比积不够精确的关键是无法完全排除压积红细胞之间的残留血浆，因此测定值比真值略高，残留量一般认为约3%。目前温氏法已属淘汰之列，渐为微量高速离心法所代顶替，因其用血量少，测定时间短，效率高。而且血浆残留量基本稳定，精度（CV）为1%-2%，但对某些血液病样品则血浆残留量仍较多。血细胞分析仪仅用微量血通过电阻抗法可进行红细胞比积测定。由于其结果是仪器测定数千个红细胞体积产生的脉冲叠加后换算的结果，因此避免了用微量高速离心法。
[参考值] 温氏法：男：0.04-0.54;女：0.37-0.47.
微量法：男：0.467±0.039;女：0.421±0.054
[临床意义] 红细胞比积增高可见于大面积烧伤和各种脱水病人，测定红细胞比积后可以了解血液浓缩程度，作为补液计算的依据。在各种贫血时，红细胞减少，红细胞比积常随之减低。但可因不同性质贫血时红细胞大小不同，两者的沽低不一定平行，临床上常用HCT值计算红细胞平均容积和红细胞平均血红蛋白浓度，有助于贫血的鉴别诊断。
（二）红细胞三种平均值的计算
在同一抗凝血标本中同时计数红细胞、测定血红蛋白量、红细胞比积。通过这三介数据，可进上步间接计算出平均红细胞容积MCV、平均红细胞血红蛋白含量平均红细胞血红蛋白浓度，以便分析病人红细胞形态特征，有助于贫血的分类与鉴别。
1．平均红细胞容积（mean corpuscular volume,MCV）
MCV=每升血液中红细胞比积/每升血液中红细胞个数=PCV×103×1012/RBC/Lfl（飞升）
[参考值] 手工法：80-92fl(1mi=1012fl),
血液分析法：80-100fl
例：红细胞3.50×1012/L，红细胞比积0.36,则：
MCV=0.36×103×1012/3.50×1012=103fl
2．平均红细胞血红蛋白含量MCH=每升血液中血红蛋白含量/每升血液中红细胞个数Hb(gL)×1012/RBC/L×PG（皮克）
[参考值] 手工法：27-31pg(1g=1012pg)
血液分析仪法：27-34pg
例：红细胞3.5×1012/L,血红蛋白120g/L(12g/dl),则
MCH=120×1012/3.5×1012=34.2PG
3．平均红细胞血红蛋白浓度MCHC=每升血液中血红蛋白含量/每升血液中红细胞比积=Hb/(g/L)/Hct
[参考值] 320-360g/L
例：血红蛋白120g/L,红细胞比积0.36,则：
MCHC=120/0。36=333G/L
（三）三种红细胞平均值的临床意义
红细胞检测是贫血诊断和疗效观察必在的实验手段。不同病因引起的贫血，各项参数变化也不同。了解贫血的病因与病理生理变化，对于正确使用、合理分析各项试验结果至关重要。
骨髓造血活动与造血组织中造血干细胞（称为CFU-S）的存在有密切关系。造血干细胞具有自我复制和分化成各系祖细胞（包括红、粒、单核、淋巴系统）等的能力。造血干细胞的增殖和分化又和造成血微环境有密切联系。造血干细胞向红系方分化过程中，经历了一个受爆增型红细胞集落刺激因子与受红细胞生成素作用的阶段，这个阶段中的细胞抵消红系祖细胞，EPO可以影响这些细胞的增殖活动，刺激血红蛋白的合成，关推进向红系细胞分化。EPO的浓度和培养时间不同，可形成BFU-E和CFU-E两种不同的集落。实BFU-E和CFU-E是红系祖细胞中两类性质不完全丰同的细胞亚群，它们在分化中的大致顺序是CFU-S→BFU-E→…CFU-E→原红细胞……网织红细胞→成熟红细胞。由于某些物理、化学或生物学因素损伤了CFU-S或使干细胞赖以生存的骨髓微环境受到破坏干细胞不能向红系转化而形成的贫血称之为再生障碍性贫血，或由于骨髓肿瘤（白血病、骨髓瘤）、骨髓纤维化使红系祖细胞条件进一步成熟致成骨髓病性贫血。如果红系祖细胞受到损伤导致选择性红细胞生成障碍或因肾损伤EPO生成减少使红系祖细胞不能进一步分化，成熟导致贫血，临床上分别自然数为单纯红细胞性再障碍和肾性贫血。由于上述病因只是作用在细胞分化阶段，并未影响细胞的增殖和成熟过程，故成熟的红细胞形态正常，上述贫血均属正细胞正色素性，从原细胞发育为成熟红细胞在经过4次分裂，最后生成16个红细胞，这一过程中至少有两个方面变化---核与胞质。所谓核的变化是指DNA要不断复制，使细胞进入增殖周期，加速细胞分裂，由于某种原因便例如叶酸或维生素B12缺乏，DNA复制所需酶的缺陷或由于抗肿瘤药物的作用的阻断DNA复制均影响幼红细胞的分裂从而导致的贫血自然数为巨幼细胞性创贫血。胞质的改变体现在血红蛋白不断合成上。血红蛋白合成需要三个要素铁、卟啉和珠蛋白，其中任何一种物质缺乏，均可导致血红蛋白合减低，细胞内充盈沽少，细胞体积小并呈明显大小不等，以小细胞为主，形成小细胞低色素性贫血，旯常见的是缺铁性贫血。成熟的红细胞可在以外周血中生存120开，衰老的红细胞被单核巨噬细胞所吞噬、破坏、脾在破坏红细胞方面尤占重要地位。红细胞生存期和红细胞膜的结构、红细胞内酶系统及血红蛋白分子等不密切关系。其中某一方面缺陷即可导致红细胞生理或形态异常，寿命缩短。如膜结构异常导致红细胞呈球形、椭圆形、口形、血红蛋白异常使红细胞呈靶形或镰形，使之不能通地这脾而夭折，临床上称为溶血性贫血。无论急性或慢性出血都是临床上引起贫血的最常见原因，慢性失血性贫血实质上就是缺铁性贫血。
从以上所述不难看出，不同病因引起的贫血，可使红细胞产生形态的变化。反之，如果用实验的手段，检查红细胞形态特点就可协助临床寻找病因，为治疗提供依据。MCV、MCH、MCHC可从不同侧面反映红细胞的病理变化。根据在某一病例中。三个指数的变化情况，可将贫血分为大细胞性贫血、正常细胞性贫血、小细胞低色素性贫血及单纯小细胞性贫血，其及标准导致该类贫血病因见表2-3。
表2-3 贫血的形态学分类鉴别表
|
贫血的形态学分类 |
MCV（FL） |
MCH（PG） |
MCHC（G/L） |
病因 |
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正常细胞性贫血 |
80～100 |
27～34 |
320～360 |
急性失血、急性溶血、造血功能低下（再障） |
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大细胞性贫血 |
大于100 |
大于34 |
320～360 |
缺乏叶酸维生素B12引起巨幼细胞性贫血 |
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单纯小红细胞性贫血 |
小于80 |
小于27 |
320～360 |
尿毒症、慢性炎症 |
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小红细胞低色素性贫血 |
小于80 |
小于27 |
小于 |
慢性失血性贫，缺铁性贫血 |
五、红细胞平均直径和红细胞直径曲线测定
红细胞直径一般用测微器在显微境下直接测定。由于每个红细胞的直径并不完全相同，因此必须测定500个红细胞的直径，才能求出红细胞平均直径。根据红细胞直径数据绘制出红细胞大小分布的曲线，称为Price—jones曲线。正常人及不同病因P-J曲结特点见图2-4。
图2-4 红细胞大小分布曲线
[方法学评价]
红细胞直径测定简单易行，不需特殊设备，对贫血的鉴别诊断有一定价值。但由于血涂片厚薄不同及推广技术差异，常使红细胞产生人为的变化；病理形态的红细胞也影响准确的直径测定，且往往受主观因素的影响，血细胞分析仪右根据测定量的单个红细胞体积，计算出体积的变异系数即RDW（见第三节），能够客观地、准确地反映红细胞大小不等程度，结合红细胞体积直方图分析，对贫血和鉴别诊断更有价值。
[参考值] 平均细胞直径6.7-7.7μm
[临床意义] 主要用于贫血的鉴别诊断：小细胞性贫血时，红细胞直径小于正常参考范围，曲线峰顶向左移，反之大细胞性贫血时峰顶右移，如有红细胞大小无不均时，见Price-Jones曲线基底部增宽，如果是正常细胞性贫血时，红细胞平均直径及其Price—Jones曲线图形与正常人的曲线相同。
六、网织红细胞计数
网织红细胞（reticulocyte）是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞。因其质内尚存留多少不等的嗜碱物质，RNA，经煌焦油蓝，新亚甲蓝活体染色法染色后，嗜碱物质凝聚成颗粒，其颗粒又可联缀成线，而构成网织状，此种红细胞即网织红细胞，仍于骨髓内停留一定时间，然后再释放入血流。因此骨髓中的网织红细胞数，不但比外周血约高3倍。而且亦较幼稚。网状结构愈多，表示该细胞越幼稚，有人将其分成一、二、三、和四级。即当红细胞内几乎被网织物充满者为一级，而红细胞内含网织物极少（上个或几个颗粒）者为四级。通常网织红细胞比成熟红细胞稍大，直径为8-9.5μm。
最新血细胞分析仪的应用，为网织红细胞计数提供了更进的测试手段。这类仪器采用荧光染色和激光测量的原理，不但能客观地测量大量网织红细胞，而且还能将其分为高荧光强度、中荧光强度、低荧光强度三类，这种分类法对估计化疗后骨髓造血功能的恢复及骨髓移植效果有较重要的意义。
[方法学评价] 由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低。试管法容易掌握，重复性效好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查，避免再次给被检者穿刺造成不必要的痛苦，被列为手工法网织红细胞计数的方法。近年来，国内使用米勒窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高。
目前，国外逐步使用网织红细胞仪器法测定大致有流式细胞仪法，网织红细胞计数仪法和多参数血液分析仪法。流式细胞仪法是将红细胞染色后使含 RNA网织红细胞可被计数，进而得出网织红细胞的百分比和绝对值，此法是只能计数网织红细胞当选目，不能分析其成熟程度，网只红细胞计数仪是专门进行网织红细胞测定的仪器操作简单，只需将抗凝血液吸入仪器内，仪器可自动染色、自动分析，自动找印各阶段网织红细胞的分布图。结果准确。仪器法的优点是测量细胞多，避免主观因素，方法易于标准化。但仪器价格昂贵，尚难以广泛应用。
[参考值] 成人：0.008-0.02或(25-75)×109/L
初生儿：0.02-0.06
[临床意义]
1．网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达0.20或更高。急性失血后5-10天，网织红细胞达高峰。2周后恢复正常。典型再生障碍性贫血病例。网织红细胞百分比常0.005。网织红细胞数低于5×109/L为诊断再生障碍性贫血的标准之一。
2．网织红细胞可作为疗效观察指标。凡是骨髓增生功能良好的病人，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在1周左右可百家高峰，贫血严重，网织红细胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。贫血病有在抗贫血治疗过程中，如果网织红细胞不见升高，说明该种治疗无效或骨髓造血功能障碍。因此网织红细胞计数是对贫血病有人经常随访检查的项目之一。
3．有人认为仅用网织红细胞百分比或者绝对值表达严寒不够确切，若贫血时骨髓生成红细胞增加，大量尚未成熟细胞释放入血，这些网织红细胞在外周血中成熟时间需2天。而正常生理情况下骨髓释放到外周血的网织红细胞，在血流中1天后其胞质中的RNA即消失。为此Finch提出在贫血时最好计处网织红细胞生成指数（reticulocyte productionindex,RPI）。它代表网织红细胞的生成相当于正常人的多少倍。
RPI=网织红细胞比值×100/2×病人红细胞比积/正常人红细胞比积
“2”为网织红细胞成熟时间（天），正常人红细胞比积，男性为0.45，女性为0.40。如红细胞比积正常时，网织红细胞成熟时间应为1天。网织红细胞比值即大油镜下选择红细胞分布均匀、网织红细胞染色好的部分计数1000个红细胞中的网织红细胞数，除以1000即为网织红细胞比值。
也可用网织红细胞校正值（corrected reticulocyte count） 报告（见下式）
网织红细胞校正值=网织红细胞比值×病人红细胞比积/正常人红细胞比积
七、点彩红细胞计数和红细胞碱泣凝集试验
（一）点彩红细胞计数
某些重金属中毒时，胞质中残存的嗜碱性物质RNA变性沉淀而形成，用瑞特染色，可见红细胞的粉红胞质中含有粗细不等的蓝黑色颗粒，如用碱性美蓝染色法，则点彩红细胞的胞质呈淡牙绿色，而颗粒为深蓝色，色泽鲜明，易于识别。
操作时用油镜按网织红细胞计数法，计数1000个红细胞中，所见点彩红细胞数，然后除以1000，即为碱性点彩红细胞的百分率。
由于点彩红细胞较少，分布不匀，有人用扩大计数面积的办法计数，这比只数1000个红细胞准确，可选择分而均匀区域，数50个视野中点彩红细胞数，然后计数5个视野内红细胞总数，再按下式求出点彩红细胞占有比值。
点彩红细胞理有比值（百分率）=50个神野内点彩红细胞数/5个视野内红细胞总数×10
注意：必须选择红细胞分布均匀的区域计数。
[参考值] 不超过3×10-4或0.0003
[临床意义] 点彩红细胞明显增多可见于铅、汞、硝基苯、苯胺等中毒病人。此外，溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、白血病、恶性肿瘤等也可见增多。
（二）红细胞碱粒凝集试验
红细胞经碱处理破裂后，溢出血红蛋白成为影细胞，如红细胞残存着RNA呈颗粒状凝集而沉积于影细胞中，再经美蓝染色后，可清晰地见到蓝色颗粒。计数方法与点彩红细胞相似。其意义与点彩红细胞相同，这铅中毒的辅助诊断指标之一。
[参考值] 0.004-0.008
[临床意义] 临床意义与点彩红细胞相同。
八、红细胞沉降率
红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation tate,ESR）是指红细胞在一定条件下沉降的速度而言，简称血沉。在健康人血沉数值波动于一个较狭窄范围内。在许多病理情况下血沉明显增快。红细胞沉降是多种因素互相作用的结果。
[原理] 血流中的红细胞，因胞膜表面的唾液所具有的负电荷等因素而互相排斥使细胞间距离为约为25nm，故彼此分散悬浮而下沉缓慢。如血浆或红细胞本身了生改变，则可使血沉了生变化。目前已知影响血沉增快或减慢的主要因素有：
1．血浆因素：在正常情况下，红细胞膜表现的唾液酸带有负电荷形成zeta电位，使红细胞互相排斥而保持悬浮稳定性，沉降很慢。但地病理情况下，血浆纤维蛋白原或球蛋白增多，致使红细胞zeat电位降低，彼此易于沾边成缗钱状，此种聚集的红细胞团块与血液接触的总面积缩小，受到血浆的阻力减弱而使血沉加快，而白蛋白、糖蛋白等可使血沉减慢。此外血脂与血沉有关，胆固醇可使血沉加快，而卵磷脂可使血沉减慢。
2．红细胞因素：正常情况下，红细胞沉降力和血浆回流阻逆力大体平衡，血沉缓慢。如遇严重贫血，由于红细胞减少总面积，承受血浆的阻逆力减小，因此血沉加恰似。反之，红细胞增多症的血沉减慢，红细胞形状对血沉也有一定影响，红细胞直径愈大，厚度愈小，血沉愈快。而球形红细胞不易形成缗钱状，所以血沉缓慢。
3．血沉管的位置：当血沉管垂直而立时，红细胞所受阻逆力最大。当血沉管倾斜时，红细胞多沿一侧下降，而血浆在另一侧上升，致使血沉加快。
[方法学评价] 血沉测定的方法有多种，有魏氏法（Westergren法）、库氏法（Coulter法、）、温氏法（Wintobe-landsbrey法）、潘氏法。其差别在于抗凝剂、用血量、血沉管、观察时间以及记录结果方面不同。库氏法每5分钟记录一海外侨胞结果，它除获得1小时沉降结果外，还可以看到这段时间内沉降曲线，对结核病灶活动与否及预后判断后有一定价值。Wintrobe –landsbery提出了贫血时血沉校正曲线，或消除贫血对血沉结果的影响。潘氏法不需从静脉采血，仅须指端血即可，但常受组织液混入的影响。上述各方法均有其优点、缺点，国际血液学标准化委员会推荐魏氏法为标准法，并对器材和操作方法做出了严格的规定，国外已有一次性使用的塑料血沉管及其附件高品供应，避免了乙肝病毒的交叉感染，同时还设计专用的自动化仪器，自动读数并打印出结果。我国在1983年全国临床检验方法学学术会议上推荐魏氏法作为参考方法。
专用于血沉测定的仪器有两种：一种是魏多法自动血沉测定仪或尖似仪器自动记录后转换成魏多法测定值；另一种是zeta红细胞比值测定，前者其取血、抗凝、装入血沉管等步骤均与常规操作相同，只是将听管垂直立于具有自动计时装置的血沉架之后，可于30，60，120分钟时分别自动记录其结果。
1972年Bull发明了Zetafuhe离心机来测定 zeta红细胞沉降率(ZSR)。将病人抗凝血注入特制血沉管中，置于特制的离心机内，以400r/min正反方向旋转，每次45秒钟，旋转4次共3min，在改变放置方向时的同时，能将沉降管自动作180度旋转，促使红细胞密集分散4次，借红细胞自身重力向下呈Z形下降，闱取zeta红细胞比积值，然后再行高速离心沉淀最真实的红细胞比积值，用HCT除以ZCT即得ZSR值，据报道其参考范围为0.4747±0.0285,ZSR增大代表血沉增快。但该法尚未得到公认。
ZSR测定的优点有不受年龄、性别、朊贫血及闭幕式验条件的影响，筛选潜在性疾病的敏感性高，测定时间短等。
[参考值] 魏氏（Westergren）法：成年男性0-15mm/h
成年女性0-20mm/h
潘氏法：成年男性0-10mm/h
成年女性0-12mm/h
[临床意义]
1．血沉增快在临床上更为常见，魏氏法不论男女其血沉值达25mm/h时，为轻度增快；达50mm/h时为中度增快；大于50mm/h 则为重度快。潘氏法不论男女血沉达20mm/h者均为增快。
（1）生理性增快：妇女月经血沉略增快，可能与子宫内膜破伤及出血有关，妊娠3年月以上血沉逐渐增快，可达30mm/h或更多，直到分娩后3周，如无关发症则逐渐如无关发症则逐渐恢复正常。其增快可能与生理性贫血、纤维蛋白原量逐渐增高、胎盘剥离、产伤等有关。60岁以上的高龄者因血浆纤维原蛋白量逐渐增高等，也常见血沉增快。
（2）病理性增快：①各种炎症：细菌性急性炎症时，血中急性反应相物质（acutephase reactant）迅速增多，包括α1抗胰蛋白酶（α-antirypsin）、α2巨蛋白（α2-mactoglobulin）、C反应蛋白（C reactive protein）、肝珠蛋白(haptoglobin )、运铁蛋白(transferrin)、纤维蛋白原(fibrinogen)等，主要因有释放增多甚至制造加强所致。以上成分或爽或者少地均能促进红细胞的缗线状聚集，故炎症发生后2-3天即可见血沉增快。风湿热的病理改变结缔组织性炎病症，其活动期血沉增快。慢性炎症如结核病时，纤维蛋白原及免疫球蛋白含量增加，血沉蝗显增快。临床上最常用血沉来观察结核病及风湿热有无活动性及其动态变化。②组织损伤及坏死：较大的手术创伤可导致血沉境快，如无合并症，一般2-3周内恢复正常。心肌梗塞时常于发病后3-4天血沉增快，并持续1-3周，心绞痛时血沉正常，故可借血沉结果加以鉴别；组织损伤坏死等引起血沉增快的机理大体同时。③恶性肿瘤：ESR加快可能与肿瘤细胞分泌糖蛋白（属球蛋白）、肿瘤组织二坏死、继发感染及恶液化气质贫血等因素有并。良性肿瘤血沉多正常，故常用血沉作为恶性肿瘤及一般X线检查等所不能查见的恶性肿瘤。对于恶性肿瘤病人增快的血沉，可因手术切除或化疗放疗较彻底而渐趋正常，复发或转移时又见增快。④各种原因导致的高球蛋白血症（hyperglobuinemia）:亚急性感染性心内膜炎、黑热病、系统性红斑狼疮等所致的高球蛋白血症时，血沉常明显增快略种原因引起的相对性球蛋白增高如慢性肾炎、肝硬化时血沉亦常增快。多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症时，浆细胞的恶性增殖致使血浆病理性球蛋白高达40-100g/L或更高，故血沉增快。巨球蛋白症病人，血浆中 IgM 增多，其血沉理应增快，但若IgM明显增多而使血浆沾稠度增高即高沾综合征时，反而抑制血沉，可得出一个正常甚至减慢的结果。⑤贫血：轻度贫血对血沉尚无影响，若血红蛋白低于90g/L时，血沉可因而增快，贫血越严重，血沉增快越明显，乃因红细胞数量稀少，下沉时受到的磨擦阻力减少等所致。故明显贫积压病人作血沉检查时应进行贫血因素的校正，而报告其校正后的结果。低色素性贫备量，因红细胞体积减小，内含血红蛋白量不足而下沉缓慢；遗传性球形细胞增多症、镰形细胞性贫时，由于其形态学的改变不利于缗钱状聚集，故其血沉结果均常降低。⑥高胆固醇积压症：特别是动脉粥样硬化血胆固醇明显增高者，血沉每见增快。
炎症时白细胞计数与血沉结果起来分析对辅助诊断及疗效观察更不有益。白细胞的增高及其分类变化直接受细菌素、组织分解产生等影响，故变化出现早，对急性炎症的诊断、疗效观察更为重要，而血沉增快乃继发于急性反应时相产物的增多，特别是受纤维蛋白原和球蛋白增高等影响，相对来说，出现较晚，故对观察慢性炎症特别是判断疗效更有价值。鉴于血沉增快大多因血浆中蛋白质成分改变所引起，而这种改变一旦发生并不能迅速消除，因此复查血沉的间隔时间不宜太短，至少需一周。
2．血沉减慢意义较小，可因红细胞数量明显增多及纤维蛋白原含量严重减低所致见于各种原因所致的脱水血浓缩、真性红细胞增多症和弥漫性血管内凝血等。
