植物原生质体的分离、融合和培养

植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

    植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。1954年，植物单细胞培养才获得成功。Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。

 实验目的：

  了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程

 实验原理：

　　植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

　　许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融合法：

　　PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。

　　PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。

[实验内容]   1．原生质体分离   2．原生质体融合    3．原生质体及融合体的培养

材料用品：

    三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台

实验步骤：

1．溶液及培养基的配制

(1)酶液	(2)PEG融合液	(3)13％CPW洗液
1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇 0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.0	40% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4	27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2·2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 13％ W／V甘露醇 pH 6.0

(4)20％蔗糖溶液

(5)黄瓜种子萌发与生根培养基（固体）：1/2MS（注：MS无机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂0.7%）

(6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基(固体和液体)：MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA(MS成份见 )

(7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基(固体)：MS+5mg/L NAA

(8) 无菌蒸馏水

(9) 0.1% HgCl2

注：以上（1）-（4）溶液均要用孔径0.2μm滤膜过滤以除去细菌。（5）-（8）培养基等要进行高压灭菌

2．黄瓜无菌苗的培养

精选饱满的黄瓜种子，浸种20～30min后，用0.1% HgCl2表面消毒8～10min，无菌水洗涤4～5次，剥皮，种子接入1/2MS培养基中。置于温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。

3．原生质体的分离

取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml l3％CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20％蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120％蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与13％ CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。

用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml l3％CPW洗液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清．用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml（请参考细胞计数）之间。

4．原生质体融合

将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴入小培养皿，静置8—10分钟。相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次即可进行培养：

5．观察

两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合．核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。

6．培养(培养基的配制方法)

将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅层培养，在温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。