D-荧光素钾盐/钠盐体内使用手册
- 北京启维益成科技有限公司2014年8月26日 14:33 点击：2099
注：以下翻译仅供参考，最终使用者请以英文原文说明书为准！！
介绍
荧光素是一种常用的荧光素酶表达的活体成像生物发光报告子。以ATP和Mg2+作为辅因子，有氧条件下荧火虫荧光素酶与水溶性底物反应发出一种特有的黄绿色发射光，在37℃活体内转换为红光。该反应通过消耗ATP来指示是否存在能量或生命的存在。
D-荧光素在生物技术领域是一种常用的试剂，尤其在活体成像方面。荧光素酶被接种在研究动物中比如大鼠，小鼠，用来标记肿瘤细胞，干细胞或传染病。通过生物荧光成像这个模式系统中D-荧光素的注射可以用来实时，非侵入性监测疾病的进程或药物效率。
产品具体信息
D-荧光素钾盐
4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
KC11H7N2O3S2
分子量：318.42 g/mol
D-荧光素钠盐
4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt
NaC11H7N2O3S2.H2O
分子量：320.32 g/mol
储存：-20℃避光保存。
材料
l D-荧光素盐
u 荧光素钾盐（启维益成, G156410）
u 荧光素钠盐（启维益成,G156411）
l DPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline), without Ca2+ 或 Mg2+
l Syringe filter, 0.2um
荧光素制备
1. 室温下融解D-荧光素（钾盐或钠盐）溶于DPBS(不含钙或镁)配成终浓度为15mg/ml。
2. 用5-10ml灭菌水预湿0.22 um滤膜然后弃去灭菌水。
3. 通过准备好的0.22 um注射器式滤膜灭菌荧光素溶液。
4. 按照不同的方法接种到实验室动物中（通常荧光素通过腹腔注射或静脉注射的方式接种到动物体内）。
比如：按10ul荧光素储存液/g体重的比例来注射（正常情况下每20g小鼠注射200ul，标准150mg/kg注射）。
5. 成像之前等待10-20分钟可达到最大荧光素酶信号稳定期。
6. 完成每个动物模型的荧光素酶动力学研究，以确定其信号达峰时间和平台期。
确定动力学曲线
每个动物模型和实验设计的组织生物分布的动力学是不同的，动物模型注射完荧光素后为了确定达峰信号时间，在实验之前建议先建立每个体系的动力学曲线。
为您的动物模型的荧光素酶活性建立动力学曲线：
1. 通过以下推荐的每个所列方法（腹腔注射，静脉注射或皮下注射）注射荧光素。注射之前如果需要给动物镇静，注意这样可能使动力学曲线（荧光素酶达峰时间）稍稍延伸。根据给药途径不同荧光素的生物分布是不同的。
2. 对于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射：
a. 如果你要注射荧光素时动物依旧是清醒的，等待三分钟，然后根据您的方法选择（气体或注射麻醉）使其镇静。参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用。
b. 把已经使用镇静剂的动物放入成像室中，在注射荧光素后大约五分钟能看到荧光成像。
3. 对于静脉注射（IV）：
a. 立即对动物进行镇静（如果没有镇静）根据您的方法来选择（气体或注射麻醉）使其镇静。参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用。
b. 把已经使用镇静剂的动物放入成像室中，在注射荧光素后两分钟内能看到荧光成像。
4. 为建立荧光素酶表达的动力学曲线，对于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射方法每隔5-10分钟拍摄一次成像时间可达40-60 分钟（对于静脉注射（IV）方法：每1-5分钟拍摄一次可达20-30分钟）。（大部分注射麻醉剂可持续20-30分钟，对于完整动力学曲线研究将需要额外的剂量！）
5. 对于您的动物模型从动力学曲线中选择最佳的成像时间点。大部分动物模型对于腹腔注射或皮下注射荧光素注入动物体内后大约10-20分钟达到信号峰值，对于静脉注射荧光素没注入后2-5分钟达到峰值。
6. 腹腔注射（IP）
小鼠
1. 首先确定针的入口点。
2. 在膝关节的上部横跨腹部画一条想像的线。
3. 针应该沿着动物右侧这条线并贴近中间插入。（对于雌鼠，针的入口点位于最后一个乳头稍靠中间的部位。）
4. 针从小鼠的右侧插入避开盲肠，盲肠是腹部左侧一个大的充满液体的器官。小肠（位于右侧）不大可能被针刺穿。
5. 针的插入从插入点离尾部或横向太远如上显示将是危险的，可能会注射到后腿里，这样将会造成肌肉组织受伤。
6. 为完成腹腔注射，必须很好地控制好小鼠以防在操作过程中移动。一旦针插入到腹部避免器官受损伤。
7. 控制好小鼠并倾斜以便使其头向下，腹部露出来。
8. 用70%乙醇对注射位点进行彻底消毒。
9. 对于腹部注射我们建议用25-27 gauge直径的针，以30度角度插入腹部。
10. 针应插入大约半厘米（4-5mm）的深度。
11. 轻轻地吸出以确认针没有穿透血管，肠或膀胱。
a. 褐绿色吸出物表示针插进了小肠。
b. 黄色吸出物暗示针插进了膀胱。
12. 如果任何液体被吸出，表示您的溶液被污染了必须弃掉并用一个新的注射器和针头重新操作。
13. 如果没有液体被吸出，你可以开始注射。
14. 取出针头并记录下注射的时间，以确定信号达峰时间。
大鼠
按照小鼠腹腔注射操作流程。对于大鼠我们建议用一个25 gauge 直径的针头注射。
注意
l 确保针是倾斜的。
l 使动物的头倾斜向下为了使肠内物向下移动，以保持腹部四分区下部为空腔。
l 为了精确注射深度防止深层注射，我们建议放一根导管在针头上留出4-5mm为合适的深度。
l 确保注射体积，我们建议小鼠不超过2ml，大鼠不超过5ml（请参看附录关于不同动物和位点的不同注射体积。）
l 给大鼠注射时，用布盖在大鼠的头部防止小鼠和研究人员紧张。
静脉注射
小鼠
尾部静脉注射
采用化学或物理方法控制小鼠（参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用。）轻轻地旋转小鼠尾部使血管可见，用70%乙醇消毒，以轻微倾斜角度用（27-30 gauge）直径大小的针头插入血管。不能吸出，而是慢慢地注射并观察透明的内腔。不正确的位点在尾部将形成一个小的凸起。如果出现这种情况，取出针头在原来位点的附近重新操作。完成之后，取出针头并压住注射点。记录注射时间以确定信号达峰时间。
尾部静脉注射---深入介绍
尾部血管注射之前，诱导外围血管扩张是有益的，这样能使血管变得更明显。可以用白炽灯提高小鼠的体温或把小鼠尾部浸泡在温水中，或用血管舒张剂处理比如甲苯噻嗪或乙酰丙嗪。你也可以用光源照透尾部，这样将使血管易见和进入。
安全的水温是110℉或43℃，这个温度使小鼠感到稍温暖。虽然通过给麻醉小鼠加热是有益的，但应注意引起灼伤或过度加热。
尾部血管位于鼠尾部的两侧，表面上看就是皮肤下面。如果正确地把针头插入，你或许在针头接口处能看到或看不到血液闪过，你也能感觉到当针头通过皮下组织进入血管内腔时阻力很小，同时，通过注射，液体将轻易地流入血管，血管将变得透明的（由暗变亮）因为液体暂时代替了血液（像上面图片看到的那样）。
大鼠
尾部或隐静脉注射
尾部注射操作跟小鼠一样。
1.
把动物放到一个控制装置中并用水浴对尾部进行加热，注意不能使动物过热。
2.
紧紧拉直尾巴并旋转使静脉血管朝上。离手指1cm处插入针头。
3.
穿透皮肤表面后，重新调整注射器与尾巴平行，然后慢慢注射。
4.
取出针头前用大母指按住注射点防止出血。
对于隐静脉注射
1. 用镇静药物（参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用）控制大鼠。
2. 拉伸后腿并把毛刮掉使隐静脉露出。
3. 对注射点进行消毒像止血一样的压力压住腿的上部。
4. 把针头插入静脉并抽吸。
5. 放开按压地方并注射。
6. 完成之后取出针头并采取适当止血。
7. 记录注射时间以确定信号达峰时间。
对于大鼠静脉注射我们建议用22-25 gauge直径大小的针头。
注意
l 注射液中确定没有气泡或泡沫，这将使小动物致死。
l 牢固而温柔地控制动物。
l 勿吸入
l 注射要慢
l 对尾部进行温水浴，这样使血管显而易见。
l 溶液将很容易流进血管，如果没有流入，重新换针头重复操作一次。
l 注射之后，用大母指短暂按压注射点来止血。
皮下注射
小鼠
皮下注射一般用于注射镇静剂或用来麻醉恢复期与溶液水合作用。皮下注射途径一般缩写为SC或SQ。溶液的注射量应被限制，不能使皮肤过度伸展（那将是不舒服的），也不能进行不必要地过度水合。一般皮下注射体积是1ml或更少。
l 最常用注射部位是颈部和肩部区域的松弛皮肤。
按常规方法控制小鼠，用指头提起皮肤像一个帐篷一样。用70%乙醇消毒注射点。建议用22 gauge 直径大小的针做皮下注射。
步骤
1. 提起背部的皮肤形成一个“帐篷”。（如果小鼠是醒着的，把小鼠放到线状盖上这样在注射过程中它能用它的前爪抓紧。）
2. 背部皮肤并撑起，用手控制住小鼠然后在露出区域注射。
3. 在皮肤撑起的根部插入针头，小心针头扎着指头。您的指头应该在撑起皮肤的顶部，针头插入点的上部是安全的。握住针头平行插入动物体内避免穿透下层组织。
4. 抽吸确保针头没有进入血管。如果位置正确应该没有吸出物。
5. 以适当的速度注射完液体。
6. 取出针头并按压皮肤来封住皮肤上的针孔防止液体流出。
7. 检查动物任何渗血现象。因为液体已经积在皮下间隙，你能看到并感觉到液体的气泡，叫疱。
8. 记录注射时间以确定信号达峰时间。
一般情况下当小鼠紧紧抓住线状盖时，它们不反对皮下注射。
大鼠
按照小鼠皮下注射方法，但按住大鼠是在桌子上而不是线状笼上。建议用23-25 gauge直径大小的针，并注射不超过5ml的液体。
l 最常用的注射位点是颈部和肩部周围的松弛皮肤。
注意
l 确保注射时针的倾斜角度很重要。
l 给大鼠注射时，用布盖在大鼠的头部防止小鼠和研究人员紧张。
l 轻轻地按注射点帮助驱散气泡。
附录
表1：推荐小鼠具体注射位点，注射体积和针头大小
|
途径
|
位点
|
最大体积
|
最大针头直径
|
|
SQ
|
Scruff
|
1ml
|
22 gauge
|
|
IM
|
Caudal thigh
|
0.05ml
|
25 gauge
|
|
IP
|
Lower ventral quadrants
|
2ml
|
25 gauge
|
|
ID
|
Lateral abdomen/thorax
|
0.05ml
|
27 gauge
|
|
IV
|
Lateral tail vein
|
0.5ml
|
27 gauge
|
表2：不同给药途径和动物模型建议注射位点，针头直径大小和注射体积（出处：Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”）
|
给药途径
|
沙鼠
|
仓鼠
|
小鼠
|
大鼠
|
|
|
IM
|
位点
体积
针头直径
|
Quadriceps
≤0.03ml
＜23 gauge
|
Quadriceps,
gluteals
≤0.15ml
＜23 gauge
|
Quadriceps
≤0.03ml
＜23 gauge
|
Quadriceps,
Gluteals,triceps
≤0.25ml
＜22 gauge
|
|
IP
|
位点
体积
针头直径
|
Lower right quadrant of abdomen
≤2ml
＜25 gauge
|
Lower right quadrant of abdomen
≤3ml
＜21 gauge
|
Lower right quadrant of abdomen
≤2ml
＜25 gauge
|
Lower right quadrant of abdomen
≤5ml
＜22 gauge
|
|
IV
|
位点
体积
针头直径
|
Lateral tail vein
≤0.5ml
＜23 gauge
|
Not
recommended
|
Lateral tail
vein
≤0.5ml
＜27 gauge
|
Lateral tail vein or saphenous veins
≤2ml slowly
＜22 gauge
|
|
Intra-
gastirc
|
位点
体积
针头直径
|
Stomach
N/A
18-22 gauge
2-3cm long bulbed feeding needle
|
Stomach
N/A
18-22 gauge
4-4.5cm long bulbed feeding needle
|
Stomach
5-10ml/kg
18-22 gauge
2-3cm long bulbed feeding needle
|
Stomach
5-10ml/kg
15-18 gauge
6-8 cm long bulbed feeding needle or 8 french flexible catheter
|
|
SQ
|
位点
体积
针头直径
|
Neck, back
≤1ml
＜22 gauge
|
Neck, back
≤3ml
＜21 gauge
|
Neck, back
≤1ml
＜22 gauge
|
Neck, back,abdomen
≤5ml
＜21 gauge
|
表3：大鼠和小鼠使用不同的镇静剂药物
（IP=intraperitoneal; SC=subcutaneous; PO=per os(by mouth); IV=intravenous）
|
药物
|
大鼠剂量（mg/kg）
|
小鼠剂量（mg/kg）
|
注解
|
|
Tranquilizers/sedatives
|
|
|
|
|
Acepromazine
|
2.5 IP
|
2.0-5.0 IP; SC
|
Light sedation
|
|
Diazepam
|
2.5-5.0 IP
|
5 IP
|
Light sedation
|
|
Midazolam
|
5.0 IP
|
5.0 IP
|
Light sedation
|
|
Xylazine
|
1.0-5.0 IP
|
5.0-10.0 IP
|
Light to heavy sedation; some analgesia
|
|
anticholinergics
|
|
|
|
|
Atropine
|
0.05 IP; SC
|
0.04 SC
|
Reduces secretions; protects heart from vagal inhibition
|
|
Glycopyrrolate
|
0.5 IM
|
|
Reduces secretions; protects heart from vagal inhibition
|
|
Analgesics
|
|
|
|
|
Buprenorphine
|
0.01-0.05 SC q8-12h
|
0.01-0.05 SC q8-12h
|
For moderate to severe pain
|
|
Butorphanol
|
1.0-2.0 SC q2-4h
|
1.0-2.0 SC q4h
|
For moderate to severe pain
|
|
Ketoprophen
|
5.0 SC or PO
|
?
|
For moderate pain
|
|
meloxicam
|
1.0 SC or PO
|
?
|
For moderate pain
|
|
Injectable anesthetics
|
|
|
|
|
Ketamine+xylazine
|
75-100+10 IP
|
80-100+10 IP
|
20-30 minites surgical anesthesia
|
|
Ketamine+medetonidine
|
75+0.5 IP
|
75+1.0 IP
|
20-30 minites surgical anesthesia
|
|
Ketamine+acepromazine
|
75+2.5 IP
|
100+5 IP
|
20-30 minites surgical anesthesia
|
|
Ketamine+diazepam
|
75+5 IP
|
100+5 IP
|
20-30 minites surgical anesthesia
|
|
Ketamine+midazolam
|
75+5 IP
|
100+5 IP
|
20-30 minites surgical anesthesia
|
|
Pentobarbital sodium
|
45-50 IP
|
50-90 IP
|
anesthesia
|
|
propofol
|
10 IV
|
|
5 minites surgical anesthesia
|
文献
所有的注射方法来源于AALAS Learning Library
图片
1. Gustafson J, et al. (2009). Journal of Controlled Release, 140(3), 256-261.
2. R.A. Bollinger. Dissertation: Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.
3. Boston University, Animal Care Research Compliance.
4. Boston University, Animal Care Research Compliance.
5. LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.
6. Boston University, Animal Care Research Compliance.
7. LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.
表格
1. US National Institute of Health
2. Adapted from Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”
3. Saskatchewan Association of Veterinary Technologists(SAVT).
全年征稿 / 资讯合作
联系邮箱：kefu@labbase.net
版权与免责声明
- 凡本网注明“来源：来宝网”的所有作品，版权均属于来宝网，转载请必须注明来宝网， //www.next-search.com，违反者本网将追究相关法律责任。
- 本网转载并注明自其它来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。
