病 理 制 片 技 术 的 规 范
- 来宝网2007年7月12日 16:19 点击：4828
病理技术是病理学诊断不可分割的一部分，制片质量的好坏很大程度上影响病理医生做出正确的病理诊断。因此，保证和提高制片质量是每个病理技术员的责任。为了保证制片质量，减少差错，防范责任事故，避免医疗纠纷，有必要加强对病理技术进行科学规范管理和制片的控制，为提高临床病理诊断水平，促进临床病理学事业的发展做出我们应有的贡献。
一、 高素质技术人员的规范管理
1． 要有敬业精神，强烈的工作责任心、
2． 努力学习，刻苦钻研，掌握过硬的基本功，引进和学习新技术，工作精益求精。
3． 领导重视，为技术人员提供进修学习和提高的机会。
4． 技术员和医生，技术员与技术员互相团结，密切配合，发挥团队精神的作用、
二、 仪器设备分规范管理
1． 配备先进，高质量的仪器设备是保证和提高制片质量的重要条件、
2． 正确使用，定期维修保养，保证仪器设备在最佳的状态下工作、
三、 标本和资料档案的规范管理
1． 标本和送检单的接收
检查标本和送检单的名字是否相符，有否标本，有没有病史。标本补充固定液，送检单编号登记。
2． 资料档案的规范管理
诊断报告发出后，附有诊断报告记录的送检单、玻片和组织蜡块存档并专人保管。建立严格的资料借出制度，确保档案资料不被丢失。
四、 技术操作规范
1. 及时固定组织：应采用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用浓甲醛液1份加蒸馏水9份稀释）固定组织，因甲醛易氧化成甲酸，因此多会偏酸性，最理想的是配成中性甲醛液。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约4小时左右，然后取材时修切成大小约22 x 22mm，厚不超过2mm的组织块进行脱水。
取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。
l 常规固定液的配制
（1） 10%甲醛液
浓甲醛 10ml
蒸馏水 90ml
(2 ) 缓冲中性甲醛液
浓甲醛 10ml
PBS缓冲液（Ph7.2） 90ml
(3 ) 10%中性甲醛液
浓甲醛 10ml
蒸馏水 90ml
碳酸钙 加至饱和
•冷冻切片固定液
(1) 乙醚酒精液
无水乙醚 1份
95%酒精 1份
(2) 酒精—冰醋酸液
95%酒精 100ml
冰醋酸 3~5滴
•细胞学涂片固定液的配制
(1) 酒精—冰醋酸液
95%酒精 97ml
冰醋酸 3ml
(2) 乙醚--酒精液
95%酒精 50ml
乙醚 50ml
冰醋酸 1ml
(3) Carney`s液
无水酒精 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
2. 脱水彻底：脱水液常用乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般70%~100%的浓度），逐步置换组织内的水份。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇的时间可适当延长，高浓度乙醇脱水时间不能过长。
3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，组织脱水后转入二甲苯，依据组织的大小、厚薄，约置30~90分钟。
4. 浸蜡足够: 浸蜡多用纯净而熔点稍低(56~58度)的石蜡，浸蜡时采用三级或四级，以尽量清除二甲苯。浸蜡时间依据组织大小厚薄而定，一般为1~2少时。浸蜡时包埋机所设定的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态。这样，组织才能取得良好的浸蜡效果。如浸蜡温度过高，导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。
5. 包埋恰当:包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高(约3~5度)，否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋是时把组织最大最平切面或所需是病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。
组织包埋完后，要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。
6. 切片要薄:切片首要任务是把切片刀研磨锋利，这是能否切薄而平整切片的关键。其次要把刀架上的切片清除角调至2~5度，在此角范围内，才能切出良好蜡片。如使用一次性刀片，可转动刀座上的弧形刻度盘选取最合适的刻度(该合适刻度并不等于真正的切片清除角)。切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧或包埋少组织蜡块过硬时就会出现跳片，使蜡片成一截厚一截薄。切片的厚度应为3~4μm，对一些组织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为2~3μm 。
7。贴片烤片：切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开，并根据所用包埋石蜡的温度调节水温在42~46度左右。为了利于展平蜡片，可先把蜡片放在一缸缸约10~15%乙醇内，然后用玻片再将蜡片移至恒温贴片盆，由于水的表面张力比乙醇大，蜡片由乙醇移至水后就很容易展平。贴片时再注意“定点”和“定向”。最后即可置入约60~65度的烤片箱内烤15~30分钟，也可放在热板上烘干，蜡片就可牢固地粘附在载玻片或盖玻片上。
8． 切片在染色前必须脱蜡干净：未完全脱蜡的组织切片，染色后组织和细胞模糊不清。脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为10~20分钟，应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些，不应过短。
9. 苏木素染液一定要配好:苏木素液配制的好坏，决定染色的优劣。苏木素配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木素液煮沸。要配制自然成熟的苏木素则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木素染液的染色时间为5~20分钟，自然氧化成熟的苏木素液染色时间可以更长。
**苏木素染液的配制
(1) Harry`s苏木素
苏木素 1g
无水酒精 10ml
硫酸铝钾 20g
蒸馏水 200ml
氧化汞 0.5g
冰醋酸 8ml
分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即冷却，恢复至室温后过滤备用。
(2) 改良Lillie-Mayer`s苏木素
苏木素 2.5g
无水酒精 20ml
硫酸铝钾 5g
蒸馏水 330ml
碘酸钠 250mg
甘油 150ml
冰醋酸 10ml
分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。
(3) Mayer`s苏木素
苏木素 100mg
蒸馏水 100ml
碘酸钠 20mg
硫酸铝铵 5g
柠檬酸 100ml
水合氯醛 5g
用蒸馏水溶解苏木素后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵和水合氯醛，过滤后备用。
10．掌握好盐酸酒精的分化：这是一个重要环节。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木素染色的深浅来决定，一般是1~2秒，若切片不分化或分化不足，组织着色过深使核浆的景界不清楚；若分化过度，胞核过淡不清晰 。用Mayer`s苏木素染色，通常都不分化。盐酸酒精分化后，切片留有酸液，易使切片褪色。另一方面苏木素经流水冲洗来促兰。流水冲洗一般需15~30分钟。如要说短时间，可用碱性的促蓝液代替流水冲洗。
**盐酸--酒精分化液的配制
浓盐酸 1 ml
70%酒精 99ml
**促蓝液的配制
（1） Scott促蓝液
重碳酸钠 0.35g
硫酸镁 2g
蒸馏水 100ml
麝香草酚少量
(2 ) 氢氧化氨水溶液
浓氨水 0.1~1ml
蒸馏水 99ml
(4) 碳酸锂水溶液
碳酸锂 1g
蒸馏水 100ml
11.曙红染色要适宜: 曙红是作为对比染色，染色时不应染的太红，也不能染得太淡，否则红兰对比不鲜明。每200ml曙红水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用，如加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢失效。曙红水溶液易发霉，每缸曙红液加入甲醛液1~2滴有防霉作用。
**曙红液的配制
（1）0. 25~0.5%曙红Y水溶液
曙红Y 0.25~0.5g
蒸馏水 100ml
冰醋酸 1滴
(2)0.5曙红Y—氯化钙水溶液
曙红Y 0.5g
蒸馏水 100ml
无水氯化钙 0.5g
(3)0.25~0.5%曙红Y酒精溶液
曙红Y 0.25~0.5g
80%酒精 100ml
１２．切片脱水透明要彻底：ＨＥ染色后，要彻底脱水透明，才能进行树胶封盖，成为永久标本。如果脱水透明不彻底，封片后呈白色雾状，镜下模糊不清，过一段时间染片就褪色。脱水要经过多次无水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯进行脱水。如采用后者，染片要经过多次二甲苯以除去石炭酸。
**石炭酸—二甲苯混合液的配制
石炭酸(加热到约60度) 1份
二甲苯 3份
13.封胶要求中性，浓度适宜: 酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。国产树胶偏酸，易使切片褪色。树胶过浓，封片时容易导致气泡，树胶过稀，封片时使胶外溢，影响美观。
14. 在整个染色过程中不让切片干涸: 切片完全干涸，会使组织收缩、割裂，形成所谓”龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核。
完成染色后，每张片子要在显微镜下观察，检查制片过程中有没有发生差错。不好的片子不交给医生。
**** HE切片的质量要求
一张高质量的HE切片要做到:
1. 切片完整、贴片恰当
2. 切片较薄而均匀
3. 无皱折
4. 无刀痕
5. 染色清晰、核浆分明、透明度好
6. 无固缩、龟裂、污染
7. 封胶适当、玻片清洁
8. 字体端正、号码清楚
五、组织化学技术操作规范
组织化学技术制片与一般的制片基本相同，但在操作上有其特殊的要求。
（一） 组织化学技术对组织细胞前处理的要求
1. 组织切片方法
根据所检测物质的性质及所采用的染色方法，组织切片分为冷冻切片和石蜡切片(培养的细胞也可分为细胞涂片、细胞冷冻切片和细胞石蜡切片)。在冷冻切片中，组织细胞的各种成份丢失最少，但形态结构差，可溶性物质弥散；石蜡切片中组织细胞的许多特殊物质减少甚至丢失，酶活性降低甚至失去活性，但形态结构好，所需显示的物质定位清晰。
2． 组织的固定
无论用于冷冻切片的组织，取材越新鲜越好，以保持生物体的原状，使细胞内的化学成份尽可能保存下来。组织取材后应立即进行冷冻切片，切片可于-20度或-80度保存。若作石蜡切片，组织取材后即进行固定，因所检测的物质不同选用不同的固定液及固定时间。最常用的固定方法是用固定液浸泡组织。固定液有多种，不同的固定液具有不同的作用，至今还没有一种固定液能用于所有染色的组织固定，最常用、用途最广的是甲醛液。欲保存固定肝糖原则不能用甲醛固定液，需要用酒精固定液，如，Gender或Cranky氏固定液。在组织
固定过程中，不能溶解细胞内的化学物质，使所显示的物质不会出现移位现象，定位准确。如用酒精性固定液固定肝糖原，会将糖原颗粒推向细胞的一边，称为“极化现象”，属于一种人为改变，对定位有影响，在观察时应注意。
（二） 组织化学染色方法的基本要求
1． 组织化学染色方法要有较高的特异性，能特异地显示所需要观察的物质组织化学染色与常规HE染色不同，每种组化反应都需要某种特殊的染料、试剂或底物，需要一定的染色时间和PH环境，使该反应对所显示的物质具有一定的专属性。如显示糖原需用Schiff无色品红试剂；显示铁离子应用亚铁氰化钾和盐酸；显示碱性磷酸酶需用β-甘油磷酸钠作底物，PH9.4的环境下进行反应。在染色的操作过程中，应采用已知含有或不含有所显示的物质的标本进行阳性和阴性对照，以证实该方法的特异性和操作的准确性。如显示碱性磷酸酶，可用正常的肾组织进行对照，肾皮质碱性磷酸酶应为阳性为髓质应为阴性。也可用抑制剂和消除法进行阴性对照。如在孵育液中加入0.01mol/L的氟化钠可抑制酸性磷酸酶的活性，染色结果则为阴性，在糖原染色前，用淀粉酶消化对照的组织切片，则对照片糖原染色为阴性。
2． 组织化学染色方法要具有一定敏感性，方法越是敏感，越能检测组织细胞中含量少的物质。
3． 组织化学染色在组织或细胞内所产生的反应产物必须具有一定的颜色，该颜色越鲜艳、越深越好。显示一种物质可有不同的染色方法，阳性反应有不同的颜色，选用的方法应使阳性物颜色鲜艳，深色，而复染的底色要浅淡，这样对比才清晰，易于观察及照相。
4． 组织化学染色最后显示出来的物质要具有稳定性，尽可能不被制片过程中所用的化学试剂所影响。在染色过程中，避免使用减弱、破坏或溶解阳性物的试剂。如，着染苏丹的脂肪要用水溶性胶封片，不能经二甲苯透明和中性树胶封片。
组织化学技术的某些方法还存在着不能完善的地方，如要保持较好的组织细胞形态结构，使被检测的物质定位准确，则需要用石蜡切片染色，但组织在制作石蜡切片的固定、脱水和包埋过程中，被检测的物质会受到破坏甚至消失。如在石蜡切片中，肾组织的酸性磷酸酶活性仅保留20%；心肌的琥珀酸脱氢酶则全部失去活性。在肝糖原染色中用10%甲醛液固定肝组织可使肝糖原完全溶解消失，改用酒精性固定液可保存肝糖原，但由于固定液渗透作用，使肝糖原颗粒出现移位“极化现象”。用冷冻切片可保存大量的酶，糖原丢失极少，又不会出现“极化现象”，但组织形态结构及阳性物质定位较差。此外，冷冻切片容易出现冰晶，破坏原有的组织结构，影响观察。有些存在于组织细胞中的化学物质较为复杂，往往需要用多种染色方法来进行鉴别，如用AB（PH2.5）法可显示一般的粘液；要区分中性和酸性粘液需要用AB-PAS染色法；酸性粘液中要区分硫酸粘液和唾液酸粘液要用HID-AB染色法。
六、 免疫组织化学技术操作规范
（一） 组织切片的要求
免疫组织化学技术适用于冷冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冷冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片也适用于冷冻切片。冷冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定脱水包埋过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
（二） 组织的固定
组织经过固定可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散，常用的固定液为10%甲醛液，最好选用10%中性甲醛液，国定时间为4~6小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
（三） 载玻片的处理
组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用较好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制备：
1． 载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；
2． 2%APES水溶液浸1~2min；
3． 蒸馏水浸洗1~2min；
4． 烤干备用。
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(四)组织切片前处理
经甲醛液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理(也称抗原修复)常用的主要有以下方法:
1． 胰蛋白酶消化
将切片置入胰蛋白酶消化液 (0.2%胰蛋白酶 0.1%氯化钙水溶液 PH7.8 ) 消化30分钟，37℃。
2． 微波加热
将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率加热10分钟，自然冷却。
3． 高压锅加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。
是否进行切片前处理要按第一抗原说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。
(五)内源性过氧化物酶的消除
组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶消除，方法是用3%过氧化氢作用15分钟。
(六)酶标抗体系统中的酶与显色剂
在LSAB等常用免疫组化方法中，与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(AP 或AKP), 显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC等作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红和固蓝作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，用其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。
(七)实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者应设阳性对照。
2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
(八)抗体的保存和稀释
抗体应于低温保存，第一抗体可分成少包装于-20度保存，使用时存放在4度，不宜反复存放于4度和-20度之间。检测试剂盒一般存放于4度，不宜于-20度保存，如长时间不用可存放于-20度，解冻使用后则不能再存放于0度以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5~20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用0.01mol/L PBS Ph7. 4，在PBS中加入1%BSA和1%正常稀释后的稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
（九）染色结果的观察
1．阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜，如LCA和UCHL1等；（2）细胞质，如Keratin 和Lysozyme等；（3）细胞核，如PCNA和ER等。
2．组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性表达，但绝大多数都是非特异性染色。
3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4．组织切片背景深与下列因素有关：
（1）第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。
（2）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
（3）正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。
（4）抗体纯度不高、
（5）抗体孵育切片后洗不干净。
（十）免疫组织化学染色后的复染背景
免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有劳色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色—Mayer`s苏木素复染细胞核呈蓝色。
（十一）染色操作注意事项
1．第一抗体分为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠和抗兔抗体，不能连接错，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好比选用即是抗鼠又是抗兔的抗体。
2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37度、如果不是由于诊断急于发报告，一般一抗置于4度孵育过夜较佳。
3．用于一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
免疫组织化学技术制片的规范和质量控制
中山大学基础医学院病理教研室 梁英杰
随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。
影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。
一、免疫组织化学技术对组织切片的要求
免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。
二、组织的固定
组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。常用的固定液为10％ 福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。
三、载玻片的处理
组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用效果较好的是硅化玻片。
硅化玻片的制备：
1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
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四、组织切片前处理
经福尔马林溶液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理（也称抗原修复）常用的方法主要有：
1. 胰蛋白酶消化法
将切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化钙水溶液 pH7.8）消化30分钟，37℃。
2. 水煮法
将切片置入蒸馏水内，加热至沸腾持续10分钟，自然冷却。
3.微波加热法
常规是将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率（约800W）加热10分钟，自然冷却。
4. 高压加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。
5.联合处理法
按上述方法先进行胰蛋白酶消化，然后再进行水煮法或微波加热法或高压加热法。
是否进行切片前处理要按第一抗体说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。切片前处理不当会出现： 假阳性、假阴性或阳性定位改变
五、内源性过氧化物酶的消除
组织中的粒细胞、单核细胞及红血球等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，因此，在显色前要把这些内源性过氧化物酶消除，方法是用3％过氧化氢作用15分钟。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。
六、内源性生物素的消除
组织细胞中存在着内源性生物素，在应用与卵白素结合或生物素标记抗体的免疫组化检测系统检测组织细胞中的抗原时，内源性生物素容易与ABC法中的卵白素（avidin）或S-P（LSAB）法中的链霉菌抗生物素蛋白(streptavidin)结合，引起假阳性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除内源性生物素。消除内源性生物素的方法有：（1）用鸡蛋清或卵白素封闭。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫组化检测系统检测如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。
七、高敏感免疫组化染色方法的选用
免疫组织化学技术的特点之一是敏感性高，就是能把抗原抗体结合物特异性地放大。目前，免疫组化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般来说，抗体与抗体的连接步骤少，特异性高，敏感性低；反之，连接步骤多，特异性低，敏感性高。但是，不同公司生产的试剂盒，技术由于不断地改进和提高，在特异性和敏感性方面各有特点。各实验室可以根据自己的实际情况对照比较，合理选用。目前应用最广泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
八、第一抗体与免疫组化检测系统的正确配套
常用的第一抗体一般为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，也有羊抗的抗体。常用检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能错配，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好选用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗体。
九、酶标抗体系统中的酶与显色剂的合理选用
在S-P等常用免疫组化方法中，标记抗体的酶主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP或AKP)，显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红、固蓝或BCIP/NBT作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝、BCIP/NBT呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，因其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。
在多重免疫组化染色中，合理选用酶标抗体检测系统和显色剂，在同一切片上可以清晰地显示组织细胞中多种抗原的表达。
十、实验对照的设置
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1.阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性 ，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者更应设阳性对照。
2.阴性对照：选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
十一、免疫组织化学染色后的背景复染
免疫组织化学技术的另外一个特点是抗体在组织中的定位准确。因此，免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有蓝色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色，Mayer~{!/~}s苏木素复染细胞核呈蓝色。甲基绿复染细胞核，颜色鲜艳，特别适用于显微照相，但容易腿色。
十二、免疫组化染色结果的观察
1. 阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应
定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的组织切片前处理会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜如LCA和UCHL1等。（2）细胞浆如Keratin和Lysozyme等
（3）细胞核如PCNA和ER、PR等
2. 不当的组织切片前处理有可能出现假阳性或假阴性的结果。
3. 组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性反应，但绝大多数都是非特异性染色。
4. 染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
5. 组织切片背景深与下列因素有关：
(1)第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。
(2)显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
(3)正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。
(4)抗体纯度不高。
(5)抗体孵育切片后冲洗不干净。
十三、抗体的保存和稀释
抗体应于低温保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间。检测试剂盒一般存放于4℃，不宜于-20℃保存，如长时间不用可存放于-20℃，解冻使用后则不能再存放于0℃以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易离解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5-20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价是否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用商品化的抗体稀释液，也可以用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中加入1％BSA和10％正常血清后稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
十四、注意事项
1．石蜡切片脱蜡要彻底。
2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37℃；如果不是由于诊断急需，一抗置于4℃孵育过夜也是一种较佳的选择。
3．滴加抗体应完全覆盖组织，避免引起组织边缘效应。
病理技术的发展与现状
病理学技术包括传统病理技术和现代病理学技术。传统病理学技术（HE切片、特殊染色）是病理学的基础，大量应用于日常工作中，是提高诊断水平和现代病理技术的保证。回顾过去，病理学的重大发现，无一不是新技术的发明和应用的结果。同时新技术的应用，也受到病理诊断水平和科研能力的制约。
病理学经历了组织病理、超微病理、免疫病理和分子病理阶段。免疫病理在很大程度上解决了很多疾病的性质和来源，而分子病理学进一步揭示了发病机制（特别是病毒学检查），预后以及外源性基因在人体内的存在和内源性基因的突变和表达异常，解决了一些用蛋白水平不能解决的问题。
目前，我国病理技术主要还是以常规HE、特染和免疫组化为主，整体水平不高，处于中等以下水平。我这样说也许有很多技术员会有意见。请看一个数据：2004年，中国病理学工作委员会在全国最具代表性的15家3级甲类大型医院病理科，对5个抗体的免疫组化质量进行测评，结果合格的只有3-4家，从一个侧面反映了中国病理技术的现状。而且这4家合格单位的成绩还存在很多的水分：第一，所有切片的前处理都是由北京友谊医院统一完成的，消除了各家由于固定、脱水、切片、烤片等原因引起的抗原损失的因素；第二，很多单位对这几张片子都是精心加工的，并不代表平时的水平。也就是说加上这二条，成绩还会更差。要做好一、二张切片并不难，难的是要天天做好片子。那么造成这样的结果原因是什么？我想用我自己的经验片面的分析一下：
一、技术员的定位
中华病理学会给技术的定位是在医生指导下工作。这里容易给人造成二大误区：
1、病理诊断与病理技术是二门完全不同的学科，对于病理技术而言，医生是外行，技术员是内行，让外行来指导内行，容易让医生错误的认为技术工作的简单性。
2、容易让技术员产生被动性和依赖性。 医生说什么我做什么，丧失了主观能动性创新性。出了问题需要医生指出原因才去改。由于很多原因医生并不可能真正知道，导致很多问题不能得到正确解决。
所以，分工明确，各尽其职，充分发挥技术员的主观能动性是提高技术水平的关键。医生做好医生自己的工作，技术员也应该做好自己的工作。出现问题，做医生的只要指出自己需要什么，或者出了什么问题，至于问题的原因和解决的办法，就应该让技术员自己的解决。只有这样，才能培养技术员的独立思考能力和解决问题的能力，才能提高技术员的业务水平，才会让技术员觉得知识的重要性以及享受到解决问题的喜悦，才会领悟到工作的意义。
二、技术员本身的原因：
1） 技术员队伍整体素质不高，学历偏低。大多数病理科技术员都是中专毕业，也有的是工人转的，有的是护士转的。我也反对唯学历论，学历并不能代表一个人真正的能力，但在大多数情况下，学历还是能力的体现。经历了大学或研究生的培养学习，他们的知识面和考虑问题的思路都是不一样的。而低学历的人要学超过他们，需付出更多的努力才能达到。
2）在主观上不求上进者甚多，我这样说会引起技术员的公愤，但事实的确如此，看一下自己周围：没有理想，不思改进，做一天算一天，已是很多技术员的通病。这就和我们的体制有关，只有通过岗位竞聘，才会让技术员认识到问题的严重性。能上网关心技术的，都是好学的朋友，对整个技术队伍来说，还是极少数。
3）缺少正规的培养和学习的机会，很多技术员的技术都是师傅带徒弟式的方法教的，也有的自学了；有的尽管出去进修了，但学回来的并不一定是正确的，就是正确的，也要和自己科里的实际情况相结合，作出相应的调整，才能真正做好。还有就是缺少相互交流的机会，有关技术的会议较少，技术员出来开会的机会就更少。
4） 缺少横向比较：我到过很多片子做的很差的单位，我发现医生、技术员的自我感觉都很好，认为自己做的很不错，对“好”没有概念，如果不知道别人做的怎么样，那么对切片质量就没有一个正确的认识。有的人出去学习，走马观花，觉得没什么好学的，别人做的和自己没什么不一样。诸不知每一个人的动作都有差异，正因为这些细微的差异，导致了每个人切片质量的不一样。还有一些技术员，把一些不规范的甚至是错误的东西当成了经验来宣传、使用和推广。
5）不能正确摆正自己的位置。
程天民院士曾经说过，诊断与技术是二个轮子，缺一不可，互为依存。这话有一定的道理的，但我认为不够确切，容易让人主次不分，医生与技术员的风险与价值是不能等同的。有的技术员什么事情都要和医生比，当二者出现差异后，医技关系就开始紧张，有的就和医生顶着干，有的自暴自弃，有的甚至目空无人，孤芳自赏。我觉的任何事物都有主次，红花总要绿叶配，没有绿叶的红花会怎么样？但不能说绿叶重要就可以做红花。病理科也是一样，医生是主角，技术员是配角，技术员就是要配合医生做好工作，你既然干了技术这个工作，就应该有这样的思想准备，应该正确的面对现实。病人来看病，总是冲着医生的诊断水平来的，不会因为你的片子做得好冲着你来。我觉得病理科更像一辆列车，主任是车头，医生是车厢，技术员就像轮子。技术是决定火车额定速度的动力，病理诊断就是司机，火车的好坏，动力的大小，最终要通过火车跑的怎么样来表现出来。最终火车开的好不好，还要靠所有部件的齐心协力才行。
5） 技术员的地位
常听技术员说现在技术员的地位越来越低了，于是就感到技术工作没前途。我想这有二方面的因素，第一，你的工作有没做好。第二，随着社会的发展，改革的深入，对知识重视，医生与技术员之间的差异会增大，我想这是正常的，我们不是整天叫中国要尊重知识吗，不能因为对自己不利就不满意了，我们只有服从这个社会，而不能叫社会服从我们。人与人，工作与工作之间由于机遇不同，工作性质不同，地位与待遇也就不同，没必要比来比去。如果你不用心去做事，任何一个好工作对你来说都没有好前途。只要你把本职工作做好了，别人都会尊重你。在国外，有的国家的病理科技术员要比医生早上班4 - 5个多小时（凌晨4点多），也就是说在医生到科前，你就要把昨天取材的组织做好，放在他的桌上。我想迟早，中国也会走上这条路。我想每一人都应该有这样的观念：工作不仅是一项事业，也是一种谋生的手段，敬业，是为了更好的保住自己的饭碗。那么，技术员的地位就不可以提高了吗？不是。提高地位靠什么，靠呼吁？同情？对抗？都没有用。事物发展都有它内在的规律，只有从根本上去解决决定技术员地位的东西。那就是提高技术的知识含量，提高技术的完成质量。
三、医生与技术的关系：
1、很多人会说，技术员工作做的不好，和医生没什么关系，其实不然。最简单的如取材，如果医生取材厚薄不均，组织就处理不好，HE切片和免疫组化质量都会有影响。技术员片子做的不好，医生可以退片，要求重切，这是我们技术员应该做的；但是，如果医生取材不好，技术员要退组织，大多数医生是不会同意的。这里就存在一个不合理的现象。还有的医生提出取材不好，技术员可以自己去修一下，我不同意这样的做法，一是技术员有可能修去你需要的病变，这个责任谁负，这是一种医疗事故，是对病人的不负责；二是作为医生你应该做好你自己的本职工作。
2、医生工作和学习的态度，在很大程度上影响着技术员，医生不喜欢学习，技术员一般也不会学习。前面我说过新技术的应用，会受到病理诊断水平和科研能力的制约。如果医生什么都不懂，什么工作都不开展，技术员的业务水平也无法提高。我就碰到有的主任自己不会看特染，不懂免疫组化，却说是技术员没做好。真是比窦娥还冤，因为你连申辩的地方都没有，甚至有的还真以为自己就是这么差，在这样的工作环境下，很多技术员会逐渐丧失了自信。
3、将就。很多医生不管技术员切片做的多差，能将就的就将就，造就了技术员的惰性，我认为这是对病人的不负责，对技术员的不负责，也是对自己不负责。
4、看不起技术。这样的病理医生其实很多，认为技术员只是操作工，培养个2-3个月就可以做得很好（当然这很大程度也是我们技术员自己造成的，技术水平越差，医生就越看不起，你越看不起，我就越差，是一种恶性循环）。技术工作我认为有点象烧菜的，每个家庭都会烧。但是同样的配方，同样的油、盐、酱、醋、味精，每人做出的味道就是不一样。做菜的也分将就型的、主妇型的、厨师型的、特级厨师型的。什么是厨师？厨师不仅对色、香、味、各种菜系、营养的搭配有研究，找出存在的问题和解决的方法，不断地吸收新的知识，还要有创新的能力。目前我们大多数的技术员（包括我自己）只是涉及到病理技术的一小部分，只学了一点点皮毛，要学好技术，还有很长的一段路要走。重视技术，提高技术水平，可以减少诊断的差错，最终受益的是我们的医生和病人。
2、其他原因：
1）有科研能力的与没科研能力的病理科之间的差异
２）大医院与小医院之间的差异
3）经济发达地区与落后地区的差异
如何解决这些问题：
1、首先技术员要正确认识自己，摆正自己的位置，要自尊，自强，自爱！增强技术员的自信心，要相信自己能做到，能做的最好。
2、多学习理论知识，多向同行学习，学会总结经验，学会理论与实际相结合，学会用脑干活。
3、科学的管理和规范化操作，是解决质量问题的关键。
病理技术很多是凭经验工作，由于经验的随意性较大，导致质量的不稳定性。和国际接轨，是我们的奋斗目标，在这背景下，中华病理学会提出了病理技术规范化操作。病理技术有很多小窍门，有的是在牺牲制片质量的前提下发明的，使用者往往自己不知道。每个地方操作方法不同，导致制片质量各不相同。
规范化操作是病理制片质量的保证，而量化的管理增加了病理制片质量的稳定性。
所谓规范化，就是在操作过程中，对使用试剂种类、pH值、浓度、温度、时间以及操作的手法都有详细的规定，尽可能的减少人为的影响，减少变量，减少影响制片质量的条件。特别是在做分子技术时，更应严格按操作规则做。
所谓量化，就是把以前经验的东西用量来判定。比如说我们更换脱水试剂，一般都是要等组织不好切了才换，这样总有几天片子质量不好；也有的是几天到了就换，组织多时脱水液的水份就多，后面几天可能组织就脱不好；组织少了脱水液倒了很浪费，我们通过几年的实验，发现组织的量和试剂的更换时间有一定的规律，用量来控制脱水的更换时间更具科学性。还有苏木素、依红也是如此。
要想搞好制片质量，各地必须建立质控组织，通过技术交流和行政监督的手段，促进病理技术的发展，做好每一步。例如常规切片的注意事项：
1 . 取材
取材的好坏，直接影响切片的质量。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。
2 . 固定
固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10％福尔马林。笔者认为，10％福尔马林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响，浓度被降低致组织固定不足，而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践，本人认为以酸性12～15％的福尔马林最佳。大标本（2cm厚）一般需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时；当室温低18℃时，可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5～4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。
所以, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用，但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保存作用，所以在没有特别处理的情况下常规HE用12～15％酸性福尔马林也可以（每100毫升12～15％福尔马林液内加5毫升冰醋酸）。骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳，经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液；少数单位还可建立组织冷冻库，以便适应各种特殊的处理要求。
3. 水洗
固定后水洗（10～20分钟），通常被很多人所忽视，而水洗不彻底，容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织，更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗原的保存
4 . 脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度（原因是组织在纯酒精内时间过久，发生组织质地发生变化）容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温（温度超过35℃）、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实低浓度的酒精具有强大的穿透力，比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水，组织如果在低浓度酒精里充分脱水，在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，因此，仅需短时间就可完成，如果这时不缩短纯酒精的时间，便会引起组织发脆；如果脱水时加温，使用丙酮，还可引起组织收缩，并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点很片面，在常温下，如果不是时间过长（超过２4小时以上）二甲苯并不会引起组织过份发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织：比如子宫肌瘤等相当好切），但是当二甲苯温度超过35℃以后，极易引起组织发脆。所以本人认为，大小标本最好分开脱水，一般情况下，大标本脱水时间（室温18℃）以80％酒精2小时、95％酒精（2道）各1个半小时至2小时、纯酒精（3道）各1个半小时至2小时，二甲苯（2道）各30-60分钟为宜；小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短，与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现，室温在12～15℃时，可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间；而室温低于该温度范围时，应适当延长脱水时间（如能保证在一个恒定的温度下最佳）。更换试剂，应以量为基础，定量更换，不能等到切片不好时再去更换。否则，至少会有2～3批组织切片不好。根据我科经验，如试剂用量为500ml，每500个蜡块更换一次为宜。
5. 浸蜡
组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其他浸透剂（如火棉胶、明胶等）渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高（超过60℃），在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃（三道），第一道：石蜡30分钟；第二道：石蜡90分钟；第三道：石蜡，90分钟。浸蜡温度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蜡1：3混合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，对细胞核有媒染作用，核浆比鲜明，但容易脱片；同时对疏松组织容易散片）。有条件的可以每天打开第一道石蜡的盖子，让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附在组织上，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。
6. 包埋
用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上。修去两边的余蜡（所谓的两边，指切片时与切片刀垂直的两侧）。包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～58℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
7. 磨刀
要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学，不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片，必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块，切大标本不应超过10～15只蜡块。
8. 切片
切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，机器磨损；过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3～5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。对脱钙组织、骨髓，以及已知的钙化组织，应选用固定的刀口，以减少其他部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增加一个缺口。切片厚度一般为4～6微米，有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等等。(3)蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组织脱水不佳。补救办法：可先将蜡块溶解，取出组织，放入加热水浴的丙酮内（80℃），30～60分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。
9. 展片与捞片
展片水温应在42℃至47℃之间，这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解决：第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点；第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄;如酒精浓度过高，容易引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开，故不能用此法。最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
10. 烤片和脱蜡
烤片，一般在60℃的温箱内烤片0.5～1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37℃左右）脱蜡，最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。
11. 染色
苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为5－15分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存，容易褪色。最后入伊红复染（5－20秒）。HE染色的关键在于深浅适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆应蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。
12. 脱水和封片
切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，纯酒精2道，（正丁醇1道），二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红退色，故脱水时间可短一点，每道3－5分钟，纯酒精每道10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但用石碳酸时如不洗净，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推荐。切片经二甲苯透明后，用中性树胶封固。为增加切片的透明度，防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。所以我们规定切片必须湿封，不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节，封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片取出待封，以免切片“还潮”，形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖，也不能有气泡。最后，粘贴标签，标签必须贴于玻片左侧，编号书写清楚，最好能打印。
我希望在中华病理学会的倡导下，在各种组织的配合下，通过我们的努力，使中国的病理技术有一个质的飞跃。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策
北京友谊医院病理科（100050）
周小鸽 (zhouxg@hotmail.com)
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、 无色片
染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、 全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、 切片边缘着色
切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。
3、“阴阳脸”着色
指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、 灶片状着色
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。（2）、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（3）、制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37°C过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
5、 间质着色
着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。
6、 细胞浆着色
胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。
7、 细胞核着色
不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。
参考文献
1、 DAKO，handbook immunohistochemical staining methods. 3rd edition. 2001.
2、 周小鸽，王鹏，陆鸣等，加热抗原修复对内源性生物素的影响及其对策。中华病理学杂志. 2002, 31(6): 504-509。
现代医疗条件下尸体解剖重要性专题座谈会纪要
中华医学杂志编辑委员会
关键词:
1997年9月29日本刊编辑委员会在北京召开了现代医疗条件下尸体解剖重要性专题座谈会，出席会议的有卫生部北京医院病理科马正中教授，北京医科大学人民医院病理科郭钤新、回允中教授，北京医科大学基础医学院病理学系廖松林教授，首都医科大学北京宣武医院病理科徐庆中教授，首都医科大学北京友谊医院病理科黄受方教授，中国协和医科大学北京协和医院病理科陈杰教授等。专家们就现代医疗条件下积极开展尸体解剖工作的重要性发表了各自的见解，现简要整理如下
现代化医疗技术与尸体解剖
首都医科大学北京宣武医院病理科徐庆中：现在临床上检查技术，特别是影像学诊断已经很先进，再提倡尸体解剖是否还有必要?回答是肯定的。
在这里我介绍一个新近发生的病例，病人男，42岁，因突然意识不清10个小时住我院神经内科。病人2年来曾有间断性头痛发作，多次到过几家大医院就诊，多次CT和MRI检查，诊断为脑囊虫病。据病人讲按脑囊虫病治疗后头痛有缓解。此次住院后，请知名专家会诊，阅读了历次CT和MRI片，都支持脑囊虫病的诊断。病人入院后3天因重度昏迷抢救无效而死亡。对死者尸体解剖的结果是脑内多发性囊状转移癌(乳头状腺癌)，因肺部未能检查，推测可能来源于支气管肺癌。病人死因是颅内压增高大脑两侧海马钩回疝和小脑扁桃体疝。很显然，该例系因影像学上囊性病变而误导诊断为脑囊虫病。
现在虽然临床检查技术特别是影像学诊断技术提高了疾病诊断的正确率，许多过去诊断不了的疾病得到了及时确诊，但是不少临床经验丰富的医生主张应将先进的技术作为辅助诊断的重要手段。如象上述病例依赖先进技术误诊的病例在临床上并不少见。在美国亦有医疗技术装备很先进的医院，有相当一部分病例其生前主要疾病的诊断与死后尸体解剖所作的病理学诊断不符，即误诊。这也就是当今许多发达地区或国家在拥有了先进的诊断技术后仍坚持开展尸体解剖，并召开临床病理讨论会的重要原因之一。
在医疗技术很先进的今天仍须提倡尸体解剖，其意义在于：(1)可以进一步提高对疾病的诊断率，以脑部病变来说，CT、MRI、正电子发射断层照相术(PET)对病变定位确有很高价值，对微小病变或早期病变亦有诊断价值，但是对病变的定性诊断仅有参考价值，最后的定性诊断还是要依赖病理学诊断。近20年来，内窥镜检查和定向穿刺活检技术的发展，对病灶的性质已能作出明确诊断，但尚有一定的局限性。从研究疾病进展的角度来说，尸体解剖及全面的病理学检查则意义非常之大。(2)尸体解剖可为人体疾病研究提供材料。譬如，近20年来发达国家陆续建立脑库，就是及时采集病人死后的脑标本，在研究Alzheimer病和Parkinson病等疾病方面，已经有不少新的发现。(3)尸体解剖对教学和培训医务工作者的意义。现在，因国内不少医学院校尸体解剖很少，只得依靠录像观摩来熟悉病理解剖，很大程度上影响了年轻医务工作者密切结合临床实际及教育的直观性。
尸体解剖对培养病理医生的意义
北京医科大学基础医学院病理学系廖松林：尸体解剖不但在医学教育、提高医疗质量、促进医疗卫生事业的发展以及临床医务工作人员的培训上有重要意义，对病理工作者特别是诊断病理工作者的培训有非常重要的意义。许多病理界的老前辈都认为，未经尸体解剖培训或无尸体解剖经验的病理工作者，不能称之为完整的病理工作者，更不能称为病理学家，只能是“半个病理工作者或半个病理学家”，原因为：（1）通过尸体解剖有利于进一步提高病理工作者辨认大体及组织学病变的能力，特别在整体上辨认疾病的大体变化，更好与组织学变化结合起来分析大体变化，这样可以提高整体辨认疾病的能力。这种能力在大体诊断上，特别在冰冻切片取材时很有实用意义。（2）通过尸体解剖有利于进一步培养病理工作者分析病变，特别在整体上结合临床表现分析多种病变之间关系的能力。活检中的病变常是局部的个别器官的，而尸体解剖常见的是若干个器官都有不同性质、不同程度的病变，如何综合分析这些病变之间的关系，并能很好根据临床资料分析这些病变，这种能力的培训很难在活检中完成。通过尸体解剖分析病变之间的关系既是实践能力的培训，也是病理理论修养的培训。故未经尸体解剖培训的病理工作者难以有较强的综合分析病变之间关系的能力，而不具有这种能力的病理工作者，则不是一个完善的病理工作者。（3）通过尸体解剖可以进一步提高利用病理学知识或用所见病理学变化来解释疾病临床表现的能力，提高病理工作者为临床服务的水平。这种能力和水平的培养要在进行较大量尸体解剖基础上，通过不断总结尸体解剖经验，结合实践及理论学习才能完成。（4）通过尸体解剖可以发现一些疾病的新变化甚至可以发现一些新的疾病。作为一个既从事病理学教学、病理科研又从事诊断病理的工作者，我从自己的成长过程中体会到，只有通过尸体解剖基本正规的培训，通过大量的尸体解剖实践及相关理论及新知识的学习，并注意向临床医生学习及加强病理与临床之间的交流，才能使自己的专业技能更全面，才能更好解决病理教学、科研及诊断病理工作中一些问题，才能成为一个具有较强综合分析判断能力的病理工作者。希望没有开展尸体解剖的病理科要积极开展，暂时有困难的单位，也可开展婴幼儿或儿童的尸体解剖。
一个优秀的病理医生要有丰富的尸体解剖经验
中国医学科学中国协和医科大学北京协和医院病理科陈杰：尸体解剖工作对临床医学实践是非常重要的，尤其是对检验临床诊断、总结诊断治疗经验和教训及发现新疾病等更为重要，对推动整个医学事业的发展意义重大。即使到了20世纪90年代的今天，临床诊断的正确率仍然徘徊在70%～80%，各种先进的医疗设备亦取代不了病理学诊断。对病理医生来说，尸体解剖是最好的学习和实践过程。虽然外检标本中可提供大量的疾病信息和实际材料，但是替代不了尸体解剖，外检的局部标本代替不了尸体解剖的整体，尤其是对于病理学的初学者来说，更为重要。尸体解剖是取得全面的病理材料的最佳途径。通过对尸体解剖材料的详细检查和全面分析，并结合临床表现及各种临床检查提供的信息对疾病的全身改变加以概括，总结该疾病的发生发展过程及诊断治疗中的经验和教训。这不仅对临床医生是重要的，对病理医生认识疾病的全貌，学习系统病理学也是非常重要的。要想做一个优秀的病理医生，没有一定的尸体解剖经验是很难达到的。对于病理医生来说，尸体解剖和外检是不可缺少的两条腿，是不可偏废的。现在有些医院对尸体解剖重视的不够，可能是尸体解剖率不高的原因之一。这也在一定程度上影响了我国病理医生的质量。希望大家共同努力，把这方面的工作做好。
对提高尸体解剖率的几点建议
首都医科大学北京友谊医院病理科黄受方、卫生部北京医院病理科马正中：我们从卫生行政管理和社会宣传等方面对提高尸体解剖率提出如下建议：
1.各级卫生领导特别是三级甲等医院院长应十分重视尸体解剖工作，应将其视为医院医疗、行政任务的一部分，并作为提高医疗质量、提高临床医学教学水平、开展临床科学研究的重要措施。对目前卫生部规定的15%尸体解剖率的要求，要采取有效措施，把任务分配到各有关临床科室，予以落实。建议医院要有一位负责业务的副院长分管尸体解剖工作，对积极推动尸体解剖工作的临床医师应给予鼓励或给予一定的奖励。对未完成尸体解剖率的病房及科室主任给予适当的批评或处罚。应该把临床诊断与尸体解剖诊断的符合率作为判定医疗质量高低的一项重要的客观指标。另外，要为病理科配备足够的病理专业人员，改善尸体解剖室的工作条件和必要设备，适当提高尸体解剖人员的保健津贴。因为，尸体解剖是一项既占用人力、物力而又没有经济效益的工作，若没有经费的支持是难以普遍开展的。为此，建议从三级甲等医院的总收入或科研经费中拔出一定经费作为尸体解剖工作的专用基金。
2.医院病理科应尽量满足临床要求，积极做好尸体解剖工作，包括与临床医师及时商定尸体解剖时间，现场示教尸体解剖，尸体解剖后应及时准确地发出尸体解剖报告。对某些误诊、漏诊、术后死亡或其它有意义的病例，定期举行临床病理讨论会。病理科应将每年的尸体解剖的资料向全院报告。包括总的尸体解剖率、各科室的尸体解剖率及临床诊断与尸体解剖诊断的符合率，分析两者诊断不符合病例的原因。年轻的病理医师，必须要做一定数量的尸体解剖才能取得晋升的资格。
3.各级卫生领导部门和中华医学会有关学会应定期召开全国性或地区性尸体解剖会议，根据全国或地区性的尸体解剖资料统计分析各种疾病在全国或地区的分布规律、发病状况及其动态变化，为卫生决策提供科学依据。
4.利用各种宣传工具和宣传途径，广泛开展关于尸体解剖工作意义的宣传；做好各级领导和社会名流签名自愿贡献遗体用于医学研究的宣传指导；介绍先进国家尸体解剖情况及国内尸体解剖工作先进单位的经验。
90年代尸体解剖率持续下降的 原因及对策
北京医科大学人民医院病理科郭钤新、回允中：近年来无论国外或国内尸体解剖率均有所下降。美国尸体解剖率1970年为41%，1973年为22%，1983年已下降至15%。国内在解放前仅有少数医院可作尸体解剖，解放后至60年代中期尸体解剖率逐年上升，10年动乱期间尸体解剖率普遍下降是可以理解的，90年代虽然略有回升但仍未达到以前最高水平。以北京医科大学人民医院为例，1955～1965年尸体解剖率为29.5%～41.9%，1966～1976年尸体解剖率降至4.0%～11.4%，1977～1990年略有回升，为10.0%～24.2%，1991～1997年又降为13.9%～3.3%。我们曾对尸体解剖率下降的原因进行过分析，认为风俗迷信家属不愿将亲人遗体进行解剖已不再是主要原因，主要原因为：新的解剖条例或有关法律迟迟未颁布；各级行政领导支持的力度尚不够，不应将尸体解剖仅仅视为追究责任的手段，而应强调其在吸取临床经验教训提高医疗质量等方面的意义；临床医师专业分的过早，重实验数据轻临床实践的倾向日益严重；病理科人才、设备及福利等问题。上述原因的分析我们已作过报道，不再赘述。在这里根据我们自己的体会，从临床及病理科的角度来探讨90年代尸体解剖率持续下降的原因，我们认为，尸体解剖质量的下降也与尸体解剖率下降有关系。
尸体解剖的质量影响着临床医师争取尸体解剖的积极性。临床医师争取尸体解剖的主要目的是要了解诊断是否与临床诊断符合，希望通过尸体解剖来解释患者的临床表现、临床治疗无效及致死的原因，并总结出经验教训，对今后类似病例的处理有所帮助，对专业水平有所提高。如果尸体解剖报告太简单，总结讨论中与死者实际情况联系少，解释不了临床表现，说明不了具体病例的特点，达不到前述临床医师争取尸体解剖的目的。加之尸体解剖报告出来的时间较迟或临床病理讨论不及时等因素，均影响了临床医师对争取尸体解剖工作的热情和积极性。
面对尸体解剖质量的问题，病理科亦存在实际困难。(1)新毕业来病理科的医师多数是院方按计划分配的，并非个人志愿，对病理工作并不一定感兴趣，病理基础可能不好。(2)医学院校大学生毕业前临床见习多而真正实践少，观察住院患者的全过程(包括入院诊断如何成立，治疗方案如何制定和执行，手术或药物疗效如何观察，直至出院或死亡)的机会少，体会不到临床争取尸体解剖迫切希望知道正确答案的心情。正是由于缺少临床实践，有些年轻病理医师不甚了解临床提供的疾病名称的别名、手术方式及实验室检查结果和影像学检查的意义，这样只能按临床诊断作重点解剖，对是否阳性病变有时也认识不清楚，其结果势必影响尸体解剖的质量。(3)做一例尸体解剖所需时间和临床的手术一样长，但却较手术又脏又累，并且尚有吸入有毒气体甚至感染致病病原体的危险。另外从事尸体解剖工作却不如实验室工作那样容易出成果，容易获奖，并且出国机会多。医院在晋升、评级时往往是以发表多少科研文章为依据，而没有将尸体解剖的量和质放在考虑之列。这样很难使年轻病理医师对尸体解剖感兴趣并提高质量。(4)技术员作为尸体解剖的助手，工作繁重，既需要身体好又要有检验及医学知识。但我国迄今还没有培训这一专业人员的学校，技术员的来源靠护士或化验员转业。一个能熟练操作尸体解剖的中年技术员，其工资和晋升机会不如刚毕业的有大专学历的技士。(5)由于尸体解剖数目减少，科内学习以外检为主，很少结合临床资料讨论尸体解剖大体标本及显微镜下改变。如果科室领导对年轻医师缺少作尸体解剖的计划，过早使之独立操作或缺乏具体指导，使得尸体解剖的质量难以提高。(6)尸体解剖诊断涉及面广，要求病理医师除具有较全面的病理诊断能力外，还要有扎实的基础医学知识(特别是局部解剖、胚胎、微生物及寄生虫学等)和足够的临床(尤其是内、外、妇、儿科)实践经验，甚至对一些个别病例还应有一定的耳鼻喉及口腔等学科的知识。我国自70年代开始，临床分科越来越细，新病种、新理论及新检查方法越来越多，而且许多专业的病种越来越依靠实验室数据和影像医学的诊断，但在患者治疗无效死亡后临床又迫切希望尸体解剖能给以满意解答。在临床各专科的会议上有关疾病的分类、分级以及诊断标准等几乎开一次会就修订一次。病理医师在自己专业领域以外，迫于尸体解剖正确诊断的需要，不能不对这些临床资料进行概括了解，但面对如此繁多深奥的信息，实在是学不过来，紧跟不上，吸收不了。由于上述实际困难，在发尸体解剖报告或临床病理讨论时，如果不作充分准备，则不是茫然不知就是引用的理论老化，或对临床问题答非所问，与临床医师之间共同语言少，难以引起临床医师争取尸体解剖的兴趣。
如何提高尸体解剖率呢?我们认为：(1)对尸体解剖的全面认识及其对医学发展的重要意义，仍有再强调宣传的必要。①尸体解剖对临床价值可以概括为“3C”，即：确定诊断(confirming)、澄清疑问(clarifying)及校正错误(correcting)。据国外报道，即使在条件较好高水平较高的医院、临床诊断与尸体解剖结果仍有5%～40%不符合或8%～12%遗漏了主要诊断。我们深深体会到，尸体解剖对临床的重要价值。例如我们通过观察臀部脂肪厚度及坐骨神经的位置解决了血液病患者长期肌肉注射后药效差的原因和婴幼儿肌肉注射的正确部位；在对血液病患者进行尸体解剖时发现58%病例合并霉菌感染，为临床提供了采取相应措施的依据；对发生胸骨穿刺事故的病例作尸体解剖时，发现成人第2肋间的胸骨绝对厚度不超过1.1 cm；根据尸体解剖确定了哑门穴针刺的危险性；根据青鱼胆中毒病例尸体解剖的结果为临床提供了抢救的关键是解决肾功能衰竭的依据；通过夹层动脉瘤病例的尸体解剖，促使临床发现了更多的Marfan综合征病例。②有的疾病只有通过尸体解剖才能被发现或被确认，如艾滋病、军团病及无反应性结核病等。应该指出，只有根据尸体解剖结果作出的死亡诊断，才对生命统计有意义，卫生部门制订的全国保健方案才能符合实际情况。③尸体解剖可以正确估价新诊断方法、新手术技术及新药使用的疗效。例如提供心脏人工瓣膜长期应用后组织反应，心脏移植后出现的冠状动脉病变，发现了阿霉素对心脏毒性作用。④尸体解剖在科研、教学、法医领域以及在处理医疗事故及纠纷中有着重要作用。(2)应提高尸体解剖的质量：目前对三等甲级医院的尸体解剖率要求达到15%，只是量的提高，体现不出医疗水平即质的提高。尸体解剖时的病理改变实际包括主要疾病、合并症、并发症、手术和药物影响及死后自溶等综合病变。一般说来，尸体解剖诊断与临床主要诊断容易一致，即符合率容易确定，但致死原因却各有看法。我们建议将符合率分为主要疾病及致死原因两部分来统计。另外，误诊率及漏诊率是在以尸体解剖诊断为正确的前提下得出的结果，但尸体解剖诊断是否绝对正确?临床有无不同意见?只有通过高质量的临床病理讨论才能达到互相提高的目的。另外，从提高医疗水平角度来看，尸体解剖率的统计应包括初生儿及婴幼儿尸体解剖在内。(3)颁布尸体解剖法：目前因医院技术水平的限制，尚难以普遍在大中型医院开展尸体解剖，故公布全国性尸体解剖法时机还不成熟。但在有条件的城市可以考虑颁布地方性法规，其中至少应包括：尸体解剖的数量及质量，应将其作为晋升、评级及评奖的依据；规定尸体解剖操作者的健康补助措施，至少不应低于放射科和传染科的医务工作者；应加强病理科的建设及人员的选择和培训；享受公费医疗、劳动保护待遇及国家特殊津贴的职工，应有义务承诺死后作尸体解剖；住院费用应有减免规定；政府要对开展尸体解剖的医院承担其诊断水平及设备的评估；还应附带公布与尸体解剖有关的遗体捐献、器官移植、脑死亡及安乐死的法规与条例。
一、 高素质技术人员的规范管理
1． 要有敬业精神，强烈的工作责任心、
2． 努力学习，刻苦钻研，掌握过硬的基本功，引进和学习新技术，工作精益求精。
3． 领导重视，为技术人员提供进修学习和提高的机会。
4． 技术员和医生，技术员与技术员互相团结，密切配合，发挥团队精神的作用、
二、 仪器设备分规范管理
1． 配备先进，高质量的仪器设备是保证和提高制片质量的重要条件、
2． 正确使用，定期维修保养，保证仪器设备在最佳的状态下工作、
三、 标本和资料档案的规范管理
1． 标本和送检单的接收
检查标本和送检单的名字是否相符，有否标本，有没有病史。标本补充固定液，送检单编号登记。
2． 资料档案的规范管理
诊断报告发出后，附有诊断报告记录的送检单、玻片和组织蜡块存档并专人保管。建立严格的资料借出制度，确保档案资料不被丢失。
四、 技术操作规范
1. 及时固定组织：应采用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用浓甲醛液1份加蒸馏水9份稀释）固定组织，因甲醛易氧化成甲酸，因此多会偏酸性，最理想的是配成中性甲醛液。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约4小时左右，然后取材时修切成大小约22 x 22mm，厚不超过2mm的组织块进行脱水。
取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。
l 常规固定液的配制
（1） 10%甲醛液
浓甲醛 10ml
蒸馏水 90ml
(2 ) 缓冲中性甲醛液
浓甲醛 10ml
PBS缓冲液（Ph7.2） 90ml
(3 ) 10%中性甲醛液
浓甲醛 10ml
蒸馏水 90ml
碳酸钙 加至饱和
•冷冻切片固定液
(1) 乙醚酒精液
无水乙醚 1份
95%酒精 1份
(2) 酒精—冰醋酸液
95%酒精 100ml
冰醋酸 3~5滴
•细胞学涂片固定液的配制
(1) 酒精—冰醋酸液
95%酒精 97ml
冰醋酸 3ml
(2) 乙醚--酒精液
95%酒精 50ml
乙醚 50ml
冰醋酸 1ml
(3) Carney`s液
无水酒精 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
2. 脱水彻底：脱水液常用乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般70%~100%的浓度），逐步置换组织内的水份。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇的时间可适当延长，高浓度乙醇脱水时间不能过长。
3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，组织脱水后转入二甲苯，依据组织的大小、厚薄，约置30~90分钟。
4. 浸蜡足够: 浸蜡多用纯净而熔点稍低(56~58度)的石蜡，浸蜡时采用三级或四级，以尽量清除二甲苯。浸蜡时间依据组织大小厚薄而定，一般为1~2少时。浸蜡时包埋机所设定的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态。这样，组织才能取得良好的浸蜡效果。如浸蜡温度过高，导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。
5. 包埋恰当:包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高(约3~5度)，否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋是时把组织最大最平切面或所需是病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。
组织包埋完后，要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。
6. 切片要薄:切片首要任务是把切片刀研磨锋利，这是能否切薄而平整切片的关键。其次要把刀架上的切片清除角调至2~5度，在此角范围内，才能切出良好蜡片。如使用一次性刀片，可转动刀座上的弧形刻度盘选取最合适的刻度(该合适刻度并不等于真正的切片清除角)。切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧或包埋少组织蜡块过硬时就会出现跳片，使蜡片成一截厚一截薄。切片的厚度应为3~4μm，对一些组织如淋巴结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为2~3μm 。
7。贴片烤片：切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开，并根据所用包埋石蜡的温度调节水温在42~46度左右。为了利于展平蜡片，可先把蜡片放在一缸缸约10~15%乙醇内，然后用玻片再将蜡片移至恒温贴片盆，由于水的表面张力比乙醇大，蜡片由乙醇移至水后就很容易展平。贴片时再注意“定点”和“定向”。最后即可置入约60~65度的烤片箱内烤15~30分钟，也可放在热板上烘干，蜡片就可牢固地粘附在载玻片或盖玻片上。
8． 切片在染色前必须脱蜡干净：未完全脱蜡的组织切片，染色后组织和细胞模糊不清。脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为10~20分钟，应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些，不应过短。
9. 苏木素染液一定要配好:苏木素液配制的好坏，决定染色的优劣。苏木素配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木素液煮沸。要配制自然成熟的苏木素则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木素染液的染色时间为5~20分钟，自然氧化成熟的苏木素液染色时间可以更长。
**苏木素染液的配制
(1) Harry`s苏木素
苏木素 1g
无水酒精 10ml
硫酸铝钾 20g
蒸馏水 200ml
氧化汞 0.5g
冰醋酸 8ml
分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即冷却，恢复至室温后过滤备用。
(2) 改良Lillie-Mayer`s苏木素
苏木素 2.5g
无水酒精 20ml
硫酸铝钾 5g
蒸馏水 330ml
碘酸钠 250mg
甘油 150ml
冰醋酸 10ml
分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。
(3) Mayer`s苏木素
苏木素 100mg
蒸馏水 100ml
碘酸钠 20mg
硫酸铝铵 5g
柠檬酸 100ml
水合氯醛 5g
用蒸馏水溶解苏木素后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵和水合氯醛，过滤后备用。
10．掌握好盐酸酒精的分化：这是一个重要环节。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木素染色的深浅来决定，一般是1~2秒，若切片不分化或分化不足，组织着色过深使核浆的景界不清楚；若分化过度，胞核过淡不清晰 。用Mayer`s苏木素染色，通常都不分化。盐酸酒精分化后，切片留有酸液，易使切片褪色。另一方面苏木素经流水冲洗来促兰。流水冲洗一般需15~30分钟。如要说短时间，可用碱性的促蓝液代替流水冲洗。
**盐酸--酒精分化液的配制
浓盐酸 1 ml
70%酒精 99ml
**促蓝液的配制
（1） Scott促蓝液
重碳酸钠 0.35g
硫酸镁 2g
蒸馏水 100ml
麝香草酚少量
(2 ) 氢氧化氨水溶液
浓氨水 0.1~1ml
蒸馏水 99ml
(4) 碳酸锂水溶液
碳酸锂 1g
蒸馏水 100ml
11.曙红染色要适宜: 曙红是作为对比染色，染色时不应染的太红，也不能染得太淡，否则红兰对比不鲜明。每200ml曙红水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用，如加酸太多，可使曙红沉淀而慢慢失效。曙红水溶液易发霉，每缸曙红液加入甲醛液1~2滴有防霉作用。
**曙红液的配制
（1）0. 25~0.5%曙红Y水溶液
曙红Y 0.25~0.5g
蒸馏水 100ml
冰醋酸 1滴
(2)0.5曙红Y—氯化钙水溶液
曙红Y 0.5g
蒸馏水 100ml
无水氯化钙 0.5g
(3)0.25~0.5%曙红Y酒精溶液
曙红Y 0.25~0.5g
80%酒精 100ml
１２．切片脱水透明要彻底：ＨＥ染色后，要彻底脱水透明，才能进行树胶封盖，成为永久标本。如果脱水透明不彻底，封片后呈白色雾状，镜下模糊不清，过一段时间染片就褪色。脱水要经过多次无水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯进行脱水。如采用后者，染片要经过多次二甲苯以除去石炭酸。
**石炭酸—二甲苯混合液的配制
石炭酸(加热到约60度) 1份
二甲苯 3份
13.封胶要求中性，浓度适宜: 酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。国产树胶偏酸，易使切片褪色。树胶过浓，封片时容易导致气泡，树胶过稀，封片时使胶外溢，影响美观。
14. 在整个染色过程中不让切片干涸: 切片完全干涸，会使组织收缩、割裂，形成所谓”龟裂”现象。也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核。
完成染色后，每张片子要在显微镜下观察，检查制片过程中有没有发生差错。不好的片子不交给医生。
**** HE切片的质量要求
一张高质量的HE切片要做到:
1. 切片完整、贴片恰当
2. 切片较薄而均匀
3. 无皱折
4. 无刀痕
5. 染色清晰、核浆分明、透明度好
6. 无固缩、龟裂、污染
7. 封胶适当、玻片清洁
8. 字体端正、号码清楚
五、组织化学技术操作规范
组织化学技术制片与一般的制片基本相同，但在操作上有其特殊的要求。
（一） 组织化学技术对组织细胞前处理的要求
1. 组织切片方法
根据所检测物质的性质及所采用的染色方法，组织切片分为冷冻切片和石蜡切片(培养的细胞也可分为细胞涂片、细胞冷冻切片和细胞石蜡切片)。在冷冻切片中，组织细胞的各种成份丢失最少，但形态结构差，可溶性物质弥散；石蜡切片中组织细胞的许多特殊物质减少甚至丢失，酶活性降低甚至失去活性，但形态结构好，所需显示的物质定位清晰。
2． 组织的固定
无论用于冷冻切片的组织，取材越新鲜越好，以保持生物体的原状，使细胞内的化学成份尽可能保存下来。组织取材后应立即进行冷冻切片，切片可于-20度或-80度保存。若作石蜡切片，组织取材后即进行固定，因所检测的物质不同选用不同的固定液及固定时间。最常用的固定方法是用固定液浸泡组织。固定液有多种，不同的固定液具有不同的作用，至今还没有一种固定液能用于所有染色的组织固定，最常用、用途最广的是甲醛液。欲保存固定肝糖原则不能用甲醛固定液，需要用酒精固定液，如，Gender或Cranky氏固定液。在组织
固定过程中，不能溶解细胞内的化学物质，使所显示的物质不会出现移位现象，定位准确。如用酒精性固定液固定肝糖原，会将糖原颗粒推向细胞的一边，称为“极化现象”，属于一种人为改变，对定位有影响，在观察时应注意。
（二） 组织化学染色方法的基本要求
1． 组织化学染色方法要有较高的特异性，能特异地显示所需要观察的物质组织化学染色与常规HE染色不同，每种组化反应都需要某种特殊的染料、试剂或底物，需要一定的染色时间和PH环境，使该反应对所显示的物质具有一定的专属性。如显示糖原需用Schiff无色品红试剂；显示铁离子应用亚铁氰化钾和盐酸；显示碱性磷酸酶需用β-甘油磷酸钠作底物，PH9.4的环境下进行反应。在染色的操作过程中，应采用已知含有或不含有所显示的物质的标本进行阳性和阴性对照，以证实该方法的特异性和操作的准确性。如显示碱性磷酸酶，可用正常的肾组织进行对照，肾皮质碱性磷酸酶应为阳性为髓质应为阴性。也可用抑制剂和消除法进行阴性对照。如在孵育液中加入0.01mol/L的氟化钠可抑制酸性磷酸酶的活性，染色结果则为阴性，在糖原染色前，用淀粉酶消化对照的组织切片，则对照片糖原染色为阴性。
2． 组织化学染色方法要具有一定敏感性，方法越是敏感，越能检测组织细胞中含量少的物质。
3． 组织化学染色在组织或细胞内所产生的反应产物必须具有一定的颜色，该颜色越鲜艳、越深越好。显示一种物质可有不同的染色方法，阳性反应有不同的颜色，选用的方法应使阳性物颜色鲜艳，深色，而复染的底色要浅淡，这样对比才清晰，易于观察及照相。
4． 组织化学染色最后显示出来的物质要具有稳定性，尽可能不被制片过程中所用的化学试剂所影响。在染色过程中，避免使用减弱、破坏或溶解阳性物的试剂。如，着染苏丹的脂肪要用水溶性胶封片，不能经二甲苯透明和中性树胶封片。
组织化学技术的某些方法还存在着不能完善的地方，如要保持较好的组织细胞形态结构，使被检测的物质定位准确，则需要用石蜡切片染色，但组织在制作石蜡切片的固定、脱水和包埋过程中，被检测的物质会受到破坏甚至消失。如在石蜡切片中，肾组织的酸性磷酸酶活性仅保留20%；心肌的琥珀酸脱氢酶则全部失去活性。在肝糖原染色中用10%甲醛液固定肝组织可使肝糖原完全溶解消失，改用酒精性固定液可保存肝糖原，但由于固定液渗透作用，使肝糖原颗粒出现移位“极化现象”。用冷冻切片可保存大量的酶，糖原丢失极少，又不会出现“极化现象”，但组织形态结构及阳性物质定位较差。此外，冷冻切片容易出现冰晶，破坏原有的组织结构，影响观察。有些存在于组织细胞中的化学物质较为复杂，往往需要用多种染色方法来进行鉴别，如用AB（PH2.5）法可显示一般的粘液；要区分中性和酸性粘液需要用AB-PAS染色法；酸性粘液中要区分硫酸粘液和唾液酸粘液要用HID-AB染色法。
六、 免疫组织化学技术操作规范
（一） 组织切片的要求
免疫组织化学技术适用于冷冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冷冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片也适用于冷冻切片。冷冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定脱水包埋过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
（二） 组织的固定
组织经过固定可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散，常用的固定液为10%甲醛液，最好选用10%中性甲醛液，国定时间为4~6小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
（三） 载玻片的处理
组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用较好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制备：
1． 载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；
2． 2%APES水溶液浸1~2min；
3． 蒸馏水浸洗1~2min；
4． 烤干备用。
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(四)组织切片前处理
经甲醛液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理(也称抗原修复)常用的主要有以下方法:
1． 胰蛋白酶消化
将切片置入胰蛋白酶消化液 (0.2%胰蛋白酶 0.1%氯化钙水溶液 PH7.8 ) 消化30分钟，37℃。
2． 微波加热
将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率加热10分钟，自然冷却。
3． 高压锅加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。
是否进行切片前处理要按第一抗原说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。
(五)内源性过氧化物酶的消除
组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶消除，方法是用3%过氧化氢作用15分钟。
(六)酶标抗体系统中的酶与显色剂
在LSAB等常用免疫组化方法中，与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(AP 或AKP), 显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC等作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红和固蓝作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，用其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。
(七)实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者应设阳性对照。
2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
(八)抗体的保存和稀释
抗体应于低温保存，第一抗体可分成少包装于-20度保存，使用时存放在4度，不宜反复存放于4度和-20度之间。检测试剂盒一般存放于4度，不宜于-20度保存，如长时间不用可存放于-20度，解冻使用后则不能再存放于0度以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5~20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用0.01mol/L PBS Ph7. 4，在PBS中加入1%BSA和1%正常稀释后的稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
（九）染色结果的观察
1．阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜，如LCA和UCHL1等；（2）细胞质，如Keratin 和Lysozyme等；（3）细胞核，如PCNA和ER等。
2．组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性表达，但绝大多数都是非特异性染色。
3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4．组织切片背景深与下列因素有关：
（1）第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。
（2）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
（3）正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。
（4）抗体纯度不高、
（5）抗体孵育切片后洗不干净。
（十）免疫组织化学染色后的复染背景
免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有劳色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色—Mayer`s苏木素复染细胞核呈蓝色。
（十一）染色操作注意事项
1．第一抗体分为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠和抗兔抗体，不能连接错，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好比选用即是抗鼠又是抗兔的抗体。
2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37度、如果不是由于诊断急于发报告，一般一抗置于4度孵育过夜较佳。
3．用于一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
免疫组织化学技术制片的规范和质量控制
中山大学基础医学院病理教研室 梁英杰
随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。
影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。
一、免疫组织化学技术对组织切片的要求
免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。
二、组织的固定
组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。常用的固定液为10％ 福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。
三、载玻片的处理
组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用效果较好的是硅化玻片。
硅化玻片的制备：
1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
＊ APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA产品。
四、组织切片前处理
经福尔马林溶液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理（也称抗原修复）常用的方法主要有：
1. 胰蛋白酶消化法
将切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化钙水溶液 pH7.8）消化30分钟，37℃。
2. 水煮法
将切片置入蒸馏水内，加热至沸腾持续10分钟，自然冷却。
3.微波加热法
常规是将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率（约800W）加热10分钟，自然冷却。
4. 高压加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。
5.联合处理法
按上述方法先进行胰蛋白酶消化，然后再进行水煮法或微波加热法或高压加热法。
是否进行切片前处理要按第一抗体说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。切片前处理不当会出现： 假阳性、假阴性或阳性定位改变
五、内源性过氧化物酶的消除
组织中的粒细胞、单核细胞及红血球等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，因此，在显色前要把这些内源性过氧化物酶消除，方法是用3％过氧化氢作用15分钟。操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后。
六、内源性生物素的消除
组织细胞中存在着内源性生物素，在应用与卵白素结合或生物素标记抗体的免疫组化检测系统检测组织细胞中的抗原时，内源性生物素容易与ABC法中的卵白素（avidin）或S-P（LSAB）法中的链霉菌抗生物素蛋白(streptavidin)结合，引起假阳性。因此在加一抗 之前或在加一抗之后需要消除内源性生物素。消除内源性生物素的方法有：（1）用鸡蛋清或卵白素封闭。（2）采用不含卵白素或生物素的免疫组化检测系统检测如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。
七、高敏感免疫组化染色方法的选用
免疫组织化学技术的特点之一是敏感性高，就是能把抗原抗体结合物特异性地放大。目前，免疫组化染色方法有一步法，二步法和三步法。一般来说，抗体与抗体的连接步骤少，特异性高，敏感性低；反之，连接步骤多，特异性低，敏感性高。但是，不同公司生产的试剂盒，技术由于不断地改进和提高，在特异性和敏感性方面各有特点。各实验室可以根据自己的实际情况对照比较，合理选用。目前应用最广泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
八、第一抗体与免疫组化检测系统的正确配套
常用的第一抗体一般为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，也有羊抗的抗体。常用检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能错配，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好选用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗体。
九、酶标抗体系统中的酶与显色剂的合理选用
在S-P等常用免疫组化方法中，标记抗体的酶主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP或AKP)，显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红、固蓝或BCIP/NBT作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝、BCIP/NBT呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，因其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。
在多重免疫组化染色中，合理选用酶标抗体检测系统和显色剂，在同一切片上可以清晰地显示组织细胞中多种抗原的表达。
十、实验对照的设置
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1.阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性 ，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者更应设阳性对照。
2.阴性对照：选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
十一、免疫组织化学染色后的背景复染
免疫组织化学技术的另外一个特点是抗体在组织中的定位准确。因此，免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有蓝色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色，Mayer~{!/~}s苏木素复染细胞核呈蓝色。甲基绿复染细胞核，颜色鲜艳，特别适用于显微照相，但容易腿色。
十二、免疫组化染色结果的观察
1. 阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应
定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的组织切片前处理会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜如LCA和UCHL1等。（2）细胞浆如Keratin和Lysozyme等
（3）细胞核如PCNA和ER、PR等
2. 不当的组织切片前处理有可能出现假阳性或假阴性的结果。
3. 组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性反应，但绝大多数都是非特异性染色。
4. 染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
5. 组织切片背景深与下列因素有关：
(1)第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。
(2)显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
(3)正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。
(4)抗体纯度不高。
(5)抗体孵育切片后冲洗不干净。
十三、抗体的保存和稀释
抗体应于低温保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间。检测试剂盒一般存放于4℃，不宜于-20℃保存，如长时间不用可存放于-20℃，解冻使用后则不能再存放于0℃以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易离解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5-20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价是否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用商品化的抗体稀释液，也可以用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中加入1％BSA和10％正常血清后稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
十四、注意事项
1．石蜡切片脱蜡要彻底。
2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37℃；如果不是由于诊断急需，一抗置于4℃孵育过夜也是一种较佳的选择。
3．滴加抗体应完全覆盖组织，避免引起组织边缘效应。
病理技术的发展与现状
病理学技术包括传统病理技术和现代病理学技术。传统病理学技术（HE切片、特殊染色）是病理学的基础，大量应用于日常工作中，是提高诊断水平和现代病理技术的保证。回顾过去，病理学的重大发现，无一不是新技术的发明和应用的结果。同时新技术的应用，也受到病理诊断水平和科研能力的制约。
病理学经历了组织病理、超微病理、免疫病理和分子病理阶段。免疫病理在很大程度上解决了很多疾病的性质和来源，而分子病理学进一步揭示了发病机制（特别是病毒学检查），预后以及外源性基因在人体内的存在和内源性基因的突变和表达异常，解决了一些用蛋白水平不能解决的问题。
目前，我国病理技术主要还是以常规HE、特染和免疫组化为主，整体水平不高，处于中等以下水平。我这样说也许有很多技术员会有意见。请看一个数据：2004年，中国病理学工作委员会在全国最具代表性的15家3级甲类大型医院病理科，对5个抗体的免疫组化质量进行测评，结果合格的只有3-4家，从一个侧面反映了中国病理技术的现状。而且这4家合格单位的成绩还存在很多的水分：第一，所有切片的前处理都是由北京友谊医院统一完成的，消除了各家由于固定、脱水、切片、烤片等原因引起的抗原损失的因素；第二，很多单位对这几张片子都是精心加工的，并不代表平时的水平。也就是说加上这二条，成绩还会更差。要做好一、二张切片并不难，难的是要天天做好片子。那么造成这样的结果原因是什么？我想用我自己的经验片面的分析一下：
一、技术员的定位
中华病理学会给技术的定位是在医生指导下工作。这里容易给人造成二大误区：
1、病理诊断与病理技术是二门完全不同的学科，对于病理技术而言，医生是外行，技术员是内行，让外行来指导内行，容易让医生错误的认为技术工作的简单性。
2、容易让技术员产生被动性和依赖性。 医生说什么我做什么，丧失了主观能动性创新性。出了问题需要医生指出原因才去改。由于很多原因医生并不可能真正知道，导致很多问题不能得到正确解决。
所以，分工明确，各尽其职，充分发挥技术员的主观能动性是提高技术水平的关键。医生做好医生自己的工作，技术员也应该做好自己的工作。出现问题，做医生的只要指出自己需要什么，或者出了什么问题，至于问题的原因和解决的办法，就应该让技术员自己的解决。只有这样，才能培养技术员的独立思考能力和解决问题的能力，才能提高技术员的业务水平，才会让技术员觉得知识的重要性以及享受到解决问题的喜悦，才会领悟到工作的意义。
二、技术员本身的原因：
1） 技术员队伍整体素质不高，学历偏低。大多数病理科技术员都是中专毕业，也有的是工人转的，有的是护士转的。我也反对唯学历论，学历并不能代表一个人真正的能力，但在大多数情况下，学历还是能力的体现。经历了大学或研究生的培养学习，他们的知识面和考虑问题的思路都是不一样的。而低学历的人要学超过他们，需付出更多的努力才能达到。
2）在主观上不求上进者甚多，我这样说会引起技术员的公愤，但事实的确如此，看一下自己周围：没有理想，不思改进，做一天算一天，已是很多技术员的通病。这就和我们的体制有关，只有通过岗位竞聘，才会让技术员认识到问题的严重性。能上网关心技术的，都是好学的朋友，对整个技术队伍来说，还是极少数。
3）缺少正规的培养和学习的机会，很多技术员的技术都是师傅带徒弟式的方法教的，也有的自学了；有的尽管出去进修了，但学回来的并不一定是正确的，就是正确的，也要和自己科里的实际情况相结合，作出相应的调整，才能真正做好。还有就是缺少相互交流的机会，有关技术的会议较少，技术员出来开会的机会就更少。
4） 缺少横向比较：我到过很多片子做的很差的单位，我发现医生、技术员的自我感觉都很好，认为自己做的很不错，对“好”没有概念，如果不知道别人做的怎么样，那么对切片质量就没有一个正确的认识。有的人出去学习，走马观花，觉得没什么好学的，别人做的和自己没什么不一样。诸不知每一个人的动作都有差异，正因为这些细微的差异，导致了每个人切片质量的不一样。还有一些技术员，把一些不规范的甚至是错误的东西当成了经验来宣传、使用和推广。
5）不能正确摆正自己的位置。
程天民院士曾经说过，诊断与技术是二个轮子，缺一不可，互为依存。这话有一定的道理的，但我认为不够确切，容易让人主次不分，医生与技术员的风险与价值是不能等同的。有的技术员什么事情都要和医生比，当二者出现差异后，医技关系就开始紧张，有的就和医生顶着干，有的自暴自弃，有的甚至目空无人，孤芳自赏。我觉的任何事物都有主次，红花总要绿叶配，没有绿叶的红花会怎么样？但不能说绿叶重要就可以做红花。病理科也是一样，医生是主角，技术员是配角，技术员就是要配合医生做好工作，你既然干了技术这个工作，就应该有这样的思想准备，应该正确的面对现实。病人来看病，总是冲着医生的诊断水平来的，不会因为你的片子做得好冲着你来。我觉得病理科更像一辆列车，主任是车头，医生是车厢，技术员就像轮子。技术是决定火车额定速度的动力，病理诊断就是司机，火车的好坏，动力的大小，最终要通过火车跑的怎么样来表现出来。最终火车开的好不好，还要靠所有部件的齐心协力才行。
5） 技术员的地位
常听技术员说现在技术员的地位越来越低了，于是就感到技术工作没前途。我想这有二方面的因素，第一，你的工作有没做好。第二，随着社会的发展，改革的深入，对知识重视，医生与技术员之间的差异会增大，我想这是正常的，我们不是整天叫中国要尊重知识吗，不能因为对自己不利就不满意了，我们只有服从这个社会，而不能叫社会服从我们。人与人，工作与工作之间由于机遇不同，工作性质不同，地位与待遇也就不同，没必要比来比去。如果你不用心去做事，任何一个好工作对你来说都没有好前途。只要你把本职工作做好了，别人都会尊重你。在国外，有的国家的病理科技术员要比医生早上班4 - 5个多小时（凌晨4点多），也就是说在医生到科前，你就要把昨天取材的组织做好，放在他的桌上。我想迟早，中国也会走上这条路。我想每一人都应该有这样的观念：工作不仅是一项事业，也是一种谋生的手段，敬业，是为了更好的保住自己的饭碗。那么，技术员的地位就不可以提高了吗？不是。提高地位靠什么，靠呼吁？同情？对抗？都没有用。事物发展都有它内在的规律，只有从根本上去解决决定技术员地位的东西。那就是提高技术的知识含量，提高技术的完成质量。
三、医生与技术的关系：
1、很多人会说，技术员工作做的不好，和医生没什么关系，其实不然。最简单的如取材，如果医生取材厚薄不均，组织就处理不好，HE切片和免疫组化质量都会有影响。技术员片子做的不好，医生可以退片，要求重切，这是我们技术员应该做的；但是，如果医生取材不好，技术员要退组织，大多数医生是不会同意的。这里就存在一个不合理的现象。还有的医生提出取材不好，技术员可以自己去修一下，我不同意这样的做法，一是技术员有可能修去你需要的病变，这个责任谁负，这是一种医疗事故，是对病人的不负责；二是作为医生你应该做好你自己的本职工作。
2、医生工作和学习的态度，在很大程度上影响着技术员，医生不喜欢学习，技术员一般也不会学习。前面我说过新技术的应用，会受到病理诊断水平和科研能力的制约。如果医生什么都不懂，什么工作都不开展，技术员的业务水平也无法提高。我就碰到有的主任自己不会看特染，不懂免疫组化，却说是技术员没做好。真是比窦娥还冤，因为你连申辩的地方都没有，甚至有的还真以为自己就是这么差，在这样的工作环境下，很多技术员会逐渐丧失了自信。
3、将就。很多医生不管技术员切片做的多差，能将就的就将就，造就了技术员的惰性，我认为这是对病人的不负责，对技术员的不负责，也是对自己不负责。
4、看不起技术。这样的病理医生其实很多，认为技术员只是操作工，培养个2-3个月就可以做得很好（当然这很大程度也是我们技术员自己造成的，技术水平越差，医生就越看不起，你越看不起，我就越差，是一种恶性循环）。技术工作我认为有点象烧菜的，每个家庭都会烧。但是同样的配方，同样的油、盐、酱、醋、味精，每人做出的味道就是不一样。做菜的也分将就型的、主妇型的、厨师型的、特级厨师型的。什么是厨师？厨师不仅对色、香、味、各种菜系、营养的搭配有研究，找出存在的问题和解决的方法，不断地吸收新的知识，还要有创新的能力。目前我们大多数的技术员（包括我自己）只是涉及到病理技术的一小部分，只学了一点点皮毛，要学好技术，还有很长的一段路要走。重视技术，提高技术水平，可以减少诊断的差错，最终受益的是我们的医生和病人。
2、其他原因：
1）有科研能力的与没科研能力的病理科之间的差异
２）大医院与小医院之间的差异
3）经济发达地区与落后地区的差异
如何解决这些问题：
1、首先技术员要正确认识自己，摆正自己的位置，要自尊，自强，自爱！增强技术员的自信心，要相信自己能做到，能做的最好。
2、多学习理论知识，多向同行学习，学会总结经验，学会理论与实际相结合，学会用脑干活。
3、科学的管理和规范化操作，是解决质量问题的关键。
病理技术很多是凭经验工作，由于经验的随意性较大，导致质量的不稳定性。和国际接轨，是我们的奋斗目标，在这背景下，中华病理学会提出了病理技术规范化操作。病理技术有很多小窍门，有的是在牺牲制片质量的前提下发明的，使用者往往自己不知道。每个地方操作方法不同，导致制片质量各不相同。
规范化操作是病理制片质量的保证，而量化的管理增加了病理制片质量的稳定性。
所谓规范化，就是在操作过程中，对使用试剂种类、pH值、浓度、温度、时间以及操作的手法都有详细的规定，尽可能的减少人为的影响，减少变量，减少影响制片质量的条件。特别是在做分子技术时，更应严格按操作规则做。
所谓量化，就是把以前经验的东西用量来判定。比如说我们更换脱水试剂，一般都是要等组织不好切了才换，这样总有几天片子质量不好；也有的是几天到了就换，组织多时脱水液的水份就多，后面几天可能组织就脱不好；组织少了脱水液倒了很浪费，我们通过几年的实验，发现组织的量和试剂的更换时间有一定的规律，用量来控制脱水的更换时间更具科学性。还有苏木素、依红也是如此。
要想搞好制片质量，各地必须建立质控组织，通过技术交流和行政监督的手段，促进病理技术的发展，做好每一步。例如常规切片的注意事项：
1 . 取材
取材的好坏，直接影响切片的质量。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。
2 . 固定
固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10％福尔马林。笔者认为，10％福尔马林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响，浓度被降低致组织固定不足，而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践，本人认为以酸性12～15％的福尔马林最佳。大标本（2cm厚）一般需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时；当室温低18℃时，可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5～4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。
所以, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用，但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保存作用，所以在没有特别处理的情况下常规HE用12～15％酸性福尔马林也可以（每100毫升12～15％福尔马林液内加5毫升冰醋酸）。骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳，经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液；少数单位还可建立组织冷冻库，以便适应各种特殊的处理要求。
3. 水洗
固定后水洗（10～20分钟），通常被很多人所忽视，而水洗不彻底，容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织，更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗原的保存
4 . 脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度（原因是组织在纯酒精内时间过久，发生组织质地发生变化）容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温（温度超过35℃）、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实低浓度的酒精具有强大的穿透力，比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水，组织如果在低浓度酒精里充分脱水，在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，因此，仅需短时间就可完成，如果这时不缩短纯酒精的时间，便会引起组织发脆；如果脱水时加温，使用丙酮，还可引起组织收缩，并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点很片面，在常温下，如果不是时间过长（超过２4小时以上）二甲苯并不会引起组织过份发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织：比如子宫肌瘤等相当好切），但是当二甲苯温度超过35℃以后，极易引起组织发脆。所以本人认为，大小标本最好分开脱水，一般情况下，大标本脱水时间（室温18℃）以80％酒精2小时、95％酒精（2道）各1个半小时至2小时、纯酒精（3道）各1个半小时至2小时，二甲苯（2道）各30-60分钟为宜；小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短，与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现，室温在12～15℃时，可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间；而室温低于该温度范围时，应适当延长脱水时间（如能保证在一个恒定的温度下最佳）。更换试剂，应以量为基础，定量更换，不能等到切片不好时再去更换。否则，至少会有2～3批组织切片不好。根据我科经验，如试剂用量为500ml，每500个蜡块更换一次为宜。
5. 浸蜡
组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其他浸透剂（如火棉胶、明胶等）渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高（超过60℃），在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃（三道），第一道：石蜡30分钟；第二道：石蜡90分钟；第三道：石蜡，90分钟。浸蜡温度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蜡1：3混合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，对细胞核有媒染作用，核浆比鲜明，但容易脱片；同时对疏松组织容易散片）。有条件的可以每天打开第一道石蜡的盖子，让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附在组织上，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。
6. 包埋
用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上。修去两边的余蜡（所谓的两边，指切片时与切片刀垂直的两侧）。包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～58℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
7. 磨刀
要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学，不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片，必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块，切大标本不应超过10～15只蜡块。
8. 切片
切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，机器磨损；过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3～5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。对脱钙组织、骨髓，以及已知的钙化组织，应选用固定的刀口，以减少其他部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增加一个缺口。切片厚度一般为4～6微米，有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等等。(3)蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组织脱水不佳。补救办法：可先将蜡块溶解，取出组织，放入加热水浴的丙酮内（80℃），30～60分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。
9. 展片与捞片
展片水温应在42℃至47℃之间，这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解决：第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点；第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄;如酒精浓度过高，容易引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开，故不能用此法。最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
10. 烤片和脱蜡
烤片，一般在60℃的温箱内烤片0.5～1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37℃左右）脱蜡，最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。
11. 染色
苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为5－15分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存，容易褪色。最后入伊红复染（5－20秒）。HE染色的关键在于深浅适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆应蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。
12. 脱水和封片
切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，纯酒精2道，（正丁醇1道），二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红退色，故脱水时间可短一点，每道3－5分钟，纯酒精每道10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但用石碳酸时如不洗净，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推荐。切片经二甲苯透明后，用中性树胶封固。为增加切片的透明度，防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。所以我们规定切片必须湿封，不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节，封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片取出待封，以免切片“还潮”，形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖，也不能有气泡。最后，粘贴标签，标签必须贴于玻片左侧，编号书写清楚，最好能打印。
我希望在中华病理学会的倡导下，在各种组织的配合下，通过我们的努力，使中国的病理技术有一个质的飞跃。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策
北京友谊医院病理科（100050）
周小鸽 (zhouxg@hotmail.com)
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
一、 无色片
染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
二、“杂音”染色片
免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
1、 全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
2、 切片边缘着色
切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：（1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。（2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。
3、“阴阳脸”着色
指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
4、 灶片状着色
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：（1）、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。（2）、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（3）、制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37°C过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
5、 间质着色
着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。
6、 细胞浆着色
胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。
7、 细胞核着色
不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。
参考文献
1、 DAKO，handbook immunohistochemical staining methods. 3rd edition. 2001.
2、 周小鸽，王鹏，陆鸣等，加热抗原修复对内源性生物素的影响及其对策。中华病理学杂志. 2002, 31(6): 504-509。
现代医疗条件下尸体解剖重要性专题座谈会纪要
中华医学杂志编辑委员会
关键词:
1997年9月29日本刊编辑委员会在北京召开了现代医疗条件下尸体解剖重要性专题座谈会，出席会议的有卫生部北京医院病理科马正中教授，北京医科大学人民医院病理科郭钤新、回允中教授，北京医科大学基础医学院病理学系廖松林教授，首都医科大学北京宣武医院病理科徐庆中教授，首都医科大学北京友谊医院病理科黄受方教授，中国协和医科大学北京协和医院病理科陈杰教授等。专家们就现代医疗条件下积极开展尸体解剖工作的重要性发表了各自的见解，现简要整理如下
现代化医疗技术与尸体解剖
首都医科大学北京宣武医院病理科徐庆中：现在临床上检查技术，特别是影像学诊断已经很先进，再提倡尸体解剖是否还有必要?回答是肯定的。
在这里我介绍一个新近发生的病例，病人男，42岁，因突然意识不清10个小时住我院神经内科。病人2年来曾有间断性头痛发作，多次到过几家大医院就诊，多次CT和MRI检查，诊断为脑囊虫病。据病人讲按脑囊虫病治疗后头痛有缓解。此次住院后，请知名专家会诊，阅读了历次CT和MRI片，都支持脑囊虫病的诊断。病人入院后3天因重度昏迷抢救无效而死亡。对死者尸体解剖的结果是脑内多发性囊状转移癌(乳头状腺癌)，因肺部未能检查，推测可能来源于支气管肺癌。病人死因是颅内压增高大脑两侧海马钩回疝和小脑扁桃体疝。很显然，该例系因影像学上囊性病变而误导诊断为脑囊虫病。
现在虽然临床检查技术特别是影像学诊断技术提高了疾病诊断的正确率，许多过去诊断不了的疾病得到了及时确诊，但是不少临床经验丰富的医生主张应将先进的技术作为辅助诊断的重要手段。如象上述病例依赖先进技术误诊的病例在临床上并不少见。在美国亦有医疗技术装备很先进的医院，有相当一部分病例其生前主要疾病的诊断与死后尸体解剖所作的病理学诊断不符，即误诊。这也就是当今许多发达地区或国家在拥有了先进的诊断技术后仍坚持开展尸体解剖，并召开临床病理讨论会的重要原因之一。
在医疗技术很先进的今天仍须提倡尸体解剖，其意义在于：(1)可以进一步提高对疾病的诊断率，以脑部病变来说，CT、MRI、正电子发射断层照相术(PET)对病变定位确有很高价值，对微小病变或早期病变亦有诊断价值，但是对病变的定性诊断仅有参考价值，最后的定性诊断还是要依赖病理学诊断。近20年来，内窥镜检查和定向穿刺活检技术的发展，对病灶的性质已能作出明确诊断，但尚有一定的局限性。从研究疾病进展的角度来说，尸体解剖及全面的病理学检查则意义非常之大。(2)尸体解剖可为人体疾病研究提供材料。譬如，近20年来发达国家陆续建立脑库，就是及时采集病人死后的脑标本，在研究Alzheimer病和Parkinson病等疾病方面，已经有不少新的发现。(3)尸体解剖对教学和培训医务工作者的意义。现在，因国内不少医学院校尸体解剖很少，只得依靠录像观摩来熟悉病理解剖，很大程度上影响了年轻医务工作者密切结合临床实际及教育的直观性。
尸体解剖对培养病理医生的意义
北京医科大学基础医学院病理学系廖松林：尸体解剖不但在医学教育、提高医疗质量、促进医疗卫生事业的发展以及临床医务工作人员的培训上有重要意义，对病理工作者特别是诊断病理工作者的培训有非常重要的意义。许多病理界的老前辈都认为，未经尸体解剖培训或无尸体解剖经验的病理工作者，不能称之为完整的病理工作者，更不能称为病理学家，只能是“半个病理工作者或半个病理学家”，原因为：（1）通过尸体解剖有利于进一步提高病理工作者辨认大体及组织学病变的能力，特别在整体上辨认疾病的大体变化，更好与组织学变化结合起来分析大体变化，这样可以提高整体辨认疾病的能力。这种能力在大体诊断上，特别在冰冻切片取材时很有实用意义。（2）通过尸体解剖有利于进一步培养病理工作者分析病变，特别在整体上结合临床表现分析多种病变之间关系的能力。活检中的病变常是局部的个别器官的，而尸体解剖常见的是若干个器官都有不同性质、不同程度的病变，如何综合分析这些病变之间的关系，并能很好根据临床资料分析这些病变，这种能力的培训很难在活检中完成。通过尸体解剖分析病变之间的关系既是实践能力的培训，也是病理理论修养的培训。故未经尸体解剖培训的病理工作者难以有较强的综合分析病变之间关系的能力，而不具有这种能力的病理工作者，则不是一个完善的病理工作者。（3）通过尸体解剖可以进一步提高利用病理学知识或用所见病理学变化来解释疾病临床表现的能力，提高病理工作者为临床服务的水平。这种能力和水平的培养要在进行较大量尸体解剖基础上，通过不断总结尸体解剖经验，结合实践及理论学习才能完成。（4）通过尸体解剖可以发现一些疾病的新变化甚至可以发现一些新的疾病。作为一个既从事病理学教学、病理科研又从事诊断病理的工作者，我从自己的成长过程中体会到，只有通过尸体解剖基本正规的培训，通过大量的尸体解剖实践及相关理论及新知识的学习，并注意向临床医生学习及加强病理与临床之间的交流，才能使自己的专业技能更全面，才能更好解决病理教学、科研及诊断病理工作中一些问题，才能成为一个具有较强综合分析判断能力的病理工作者。希望没有开展尸体解剖的病理科要积极开展，暂时有困难的单位，也可开展婴幼儿或儿童的尸体解剖。
一个优秀的病理医生要有丰富的尸体解剖经验
中国医学科学中国协和医科大学北京协和医院病理科陈杰：尸体解剖工作对临床医学实践是非常重要的，尤其是对检验临床诊断、总结诊断治疗经验和教训及发现新疾病等更为重要，对推动整个医学事业的发展意义重大。即使到了20世纪90年代的今天，临床诊断的正确率仍然徘徊在70%～80%，各种先进的医疗设备亦取代不了病理学诊断。对病理医生来说，尸体解剖是最好的学习和实践过程。虽然外检标本中可提供大量的疾病信息和实际材料，但是替代不了尸体解剖，外检的局部标本代替不了尸体解剖的整体，尤其是对于病理学的初学者来说，更为重要。尸体解剖是取得全面的病理材料的最佳途径。通过对尸体解剖材料的详细检查和全面分析，并结合临床表现及各种临床检查提供的信息对疾病的全身改变加以概括，总结该疾病的发生发展过程及诊断治疗中的经验和教训。这不仅对临床医生是重要的，对病理医生认识疾病的全貌，学习系统病理学也是非常重要的。要想做一个优秀的病理医生，没有一定的尸体解剖经验是很难达到的。对于病理医生来说，尸体解剖和外检是不可缺少的两条腿，是不可偏废的。现在有些医院对尸体解剖重视的不够，可能是尸体解剖率不高的原因之一。这也在一定程度上影响了我国病理医生的质量。希望大家共同努力，把这方面的工作做好。
对提高尸体解剖率的几点建议
首都医科大学北京友谊医院病理科黄受方、卫生部北京医院病理科马正中：我们从卫生行政管理和社会宣传等方面对提高尸体解剖率提出如下建议：
1.各级卫生领导特别是三级甲等医院院长应十分重视尸体解剖工作，应将其视为医院医疗、行政任务的一部分，并作为提高医疗质量、提高临床医学教学水平、开展临床科学研究的重要措施。对目前卫生部规定的15%尸体解剖率的要求，要采取有效措施，把任务分配到各有关临床科室，予以落实。建议医院要有一位负责业务的副院长分管尸体解剖工作，对积极推动尸体解剖工作的临床医师应给予鼓励或给予一定的奖励。对未完成尸体解剖率的病房及科室主任给予适当的批评或处罚。应该把临床诊断与尸体解剖诊断的符合率作为判定医疗质量高低的一项重要的客观指标。另外，要为病理科配备足够的病理专业人员，改善尸体解剖室的工作条件和必要设备，适当提高尸体解剖人员的保健津贴。因为，尸体解剖是一项既占用人力、物力而又没有经济效益的工作，若没有经费的支持是难以普遍开展的。为此，建议从三级甲等医院的总收入或科研经费中拔出一定经费作为尸体解剖工作的专用基金。
2.医院病理科应尽量满足临床要求，积极做好尸体解剖工作，包括与临床医师及时商定尸体解剖时间，现场示教尸体解剖，尸体解剖后应及时准确地发出尸体解剖报告。对某些误诊、漏诊、术后死亡或其它有意义的病例，定期举行临床病理讨论会。病理科应将每年的尸体解剖的资料向全院报告。包括总的尸体解剖率、各科室的尸体解剖率及临床诊断与尸体解剖诊断的符合率，分析两者诊断不符合病例的原因。年轻的病理医师，必须要做一定数量的尸体解剖才能取得晋升的资格。
3.各级卫生领导部门和中华医学会有关学会应定期召开全国性或地区性尸体解剖会议，根据全国或地区性的尸体解剖资料统计分析各种疾病在全国或地区的分布规律、发病状况及其动态变化，为卫生决策提供科学依据。
4.利用各种宣传工具和宣传途径，广泛开展关于尸体解剖工作意义的宣传；做好各级领导和社会名流签名自愿贡献遗体用于医学研究的宣传指导；介绍先进国家尸体解剖情况及国内尸体解剖工作先进单位的经验。
90年代尸体解剖率持续下降的 原因及对策
北京医科大学人民医院病理科郭钤新、回允中：近年来无论国外或国内尸体解剖率均有所下降。美国尸体解剖率1970年为41%，1973年为22%，1983年已下降至15%。国内在解放前仅有少数医院可作尸体解剖，解放后至60年代中期尸体解剖率逐年上升，10年动乱期间尸体解剖率普遍下降是可以理解的，90年代虽然略有回升但仍未达到以前最高水平。以北京医科大学人民医院为例，1955～1965年尸体解剖率为29.5%～41.9%，1966～1976年尸体解剖率降至4.0%～11.4%，1977～1990年略有回升，为10.0%～24.2%，1991～1997年又降为13.9%～3.3%。我们曾对尸体解剖率下降的原因进行过分析，认为风俗迷信家属不愿将亲人遗体进行解剖已不再是主要原因，主要原因为：新的解剖条例或有关法律迟迟未颁布；各级行政领导支持的力度尚不够，不应将尸体解剖仅仅视为追究责任的手段，而应强调其在吸取临床经验教训提高医疗质量等方面的意义；临床医师专业分的过早，重实验数据轻临床实践的倾向日益严重；病理科人才、设备及福利等问题。上述原因的分析我们已作过报道，不再赘述。在这里根据我们自己的体会，从临床及病理科的角度来探讨90年代尸体解剖率持续下降的原因，我们认为，尸体解剖质量的下降也与尸体解剖率下降有关系。
尸体解剖的质量影响着临床医师争取尸体解剖的积极性。临床医师争取尸体解剖的主要目的是要了解诊断是否与临床诊断符合，希望通过尸体解剖来解释患者的临床表现、临床治疗无效及致死的原因，并总结出经验教训，对今后类似病例的处理有所帮助，对专业水平有所提高。如果尸体解剖报告太简单，总结讨论中与死者实际情况联系少，解释不了临床表现，说明不了具体病例的特点，达不到前述临床医师争取尸体解剖的目的。加之尸体解剖报告出来的时间较迟或临床病理讨论不及时等因素，均影响了临床医师对争取尸体解剖工作的热情和积极性。
面对尸体解剖质量的问题，病理科亦存在实际困难。(1)新毕业来病理科的医师多数是院方按计划分配的，并非个人志愿，对病理工作并不一定感兴趣，病理基础可能不好。(2)医学院校大学生毕业前临床见习多而真正实践少，观察住院患者的全过程(包括入院诊断如何成立，治疗方案如何制定和执行，手术或药物疗效如何观察，直至出院或死亡)的机会少，体会不到临床争取尸体解剖迫切希望知道正确答案的心情。正是由于缺少临床实践，有些年轻病理医师不甚了解临床提供的疾病名称的别名、手术方式及实验室检查结果和影像学检查的意义，这样只能按临床诊断作重点解剖，对是否阳性病变有时也认识不清楚，其结果势必影响尸体解剖的质量。(3)做一例尸体解剖所需时间和临床的手术一样长，但却较手术又脏又累，并且尚有吸入有毒气体甚至感染致病病原体的危险。另外从事尸体解剖工作却不如实验室工作那样容易出成果，容易获奖，并且出国机会多。医院在晋升、评级时往往是以发表多少科研文章为依据，而没有将尸体解剖的量和质放在考虑之列。这样很难使年轻病理医师对尸体解剖感兴趣并提高质量。(4)技术员作为尸体解剖的助手，工作繁重，既需要身体好又要有检验及医学知识。但我国迄今还没有培训这一专业人员的学校，技术员的来源靠护士或化验员转业。一个能熟练操作尸体解剖的中年技术员，其工资和晋升机会不如刚毕业的有大专学历的技士。(5)由于尸体解剖数目减少，科内学习以外检为主，很少结合临床资料讨论尸体解剖大体标本及显微镜下改变。如果科室领导对年轻医师缺少作尸体解剖的计划，过早使之独立操作或缺乏具体指导，使得尸体解剖的质量难以提高。(6)尸体解剖诊断涉及面广，要求病理医师除具有较全面的病理诊断能力外，还要有扎实的基础医学知识(特别是局部解剖、胚胎、微生物及寄生虫学等)和足够的临床(尤其是内、外、妇、儿科)实践经验，甚至对一些个别病例还应有一定的耳鼻喉及口腔等学科的知识。我国自70年代开始，临床分科越来越细，新病种、新理论及新检查方法越来越多，而且许多专业的病种越来越依靠实验室数据和影像医学的诊断，但在患者治疗无效死亡后临床又迫切希望尸体解剖能给以满意解答。在临床各专科的会议上有关疾病的分类、分级以及诊断标准等几乎开一次会就修订一次。病理医师在自己专业领域以外，迫于尸体解剖正确诊断的需要，不能不对这些临床资料进行概括了解，但面对如此繁多深奥的信息，实在是学不过来，紧跟不上，吸收不了。由于上述实际困难，在发尸体解剖报告或临床病理讨论时，如果不作充分准备，则不是茫然不知就是引用的理论老化，或对临床问题答非所问，与临床医师之间共同语言少，难以引起临床医师争取尸体解剖的兴趣。
如何提高尸体解剖率呢?我们认为：(1)对尸体解剖的全面认识及其对医学发展的重要意义，仍有再强调宣传的必要。①尸体解剖对临床价值可以概括为“3C”，即：确定诊断(confirming)、澄清疑问(clarifying)及校正错误(correcting)。据国外报道，即使在条件较好高水平较高的医院、临床诊断与尸体解剖结果仍有5%～40%不符合或8%～12%遗漏了主要诊断。我们深深体会到，尸体解剖对临床的重要价值。例如我们通过观察臀部脂肪厚度及坐骨神经的位置解决了血液病患者长期肌肉注射后药效差的原因和婴幼儿肌肉注射的正确部位；在对血液病患者进行尸体解剖时发现58%病例合并霉菌感染，为临床提供了采取相应措施的依据；对发生胸骨穿刺事故的病例作尸体解剖时，发现成人第2肋间的胸骨绝对厚度不超过1.1 cm；根据尸体解剖确定了哑门穴针刺的危险性；根据青鱼胆中毒病例尸体解剖的结果为临床提供了抢救的关键是解决肾功能衰竭的依据；通过夹层动脉瘤病例的尸体解剖，促使临床发现了更多的Marfan综合征病例。②有的疾病只有通过尸体解剖才能被发现或被确认，如艾滋病、军团病及无反应性结核病等。应该指出，只有根据尸体解剖结果作出的死亡诊断，才对生命统计有意义，卫生部门制订的全国保健方案才能符合实际情况。③尸体解剖可以正确估价新诊断方法、新手术技术及新药使用的疗效。例如提供心脏人工瓣膜长期应用后组织反应，心脏移植后出现的冠状动脉病变，发现了阿霉素对心脏毒性作用。④尸体解剖在科研、教学、法医领域以及在处理医疗事故及纠纷中有着重要作用。(2)应提高尸体解剖的质量：目前对三等甲级医院的尸体解剖率要求达到15%，只是量的提高，体现不出医疗水平即质的提高。尸体解剖时的病理改变实际包括主要疾病、合并症、并发症、手术和药物影响及死后自溶等综合病变。一般说来，尸体解剖诊断与临床主要诊断容易一致，即符合率容易确定，但致死原因却各有看法。我们建议将符合率分为主要疾病及致死原因两部分来统计。另外，误诊率及漏诊率是在以尸体解剖诊断为正确的前提下得出的结果，但尸体解剖诊断是否绝对正确?临床有无不同意见?只有通过高质量的临床病理讨论才能达到互相提高的目的。另外，从提高医疗水平角度来看，尸体解剖率的统计应包括初生儿及婴幼儿尸体解剖在内。(3)颁布尸体解剖法：目前因医院技术水平的限制，尚难以普遍在大中型医院开展尸体解剖，故公布全国性尸体解剖法时机还不成熟。但在有条件的城市可以考虑颁布地方性法规，其中至少应包括：尸体解剖的数量及质量，应将其作为晋升、评级及评奖的依据；规定尸体解剖操作者的健康补助措施，至少不应低于放射科和传染科的医务工作者；应加强病理科的建设及人员的选择和培训；享受公费医疗、劳动保护待遇及国家特殊津贴的职工，应有义务承诺死后作尸体解剖；住院费用应有减免规定；政府要对开展尸体解剖的医院承担其诊断水平及设备的评估；还应附带公布与尸体解剖有关的遗体捐献、器官移植、脑死亡及安乐死的法规与条例。
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