pH值对L-抗坏血酸―赖氨酸/甲硫氨酸Maillard反应产物的抗氧化活性的影响

 pH值对L-抗坏血酸―赖氨酸/甲硫氨酸Maillard反应产物的抗氧化活性的影响 

作者：朱霄龙1， 景 玮2（本文著作权归作者所有，未经授权不得转载！）
（1. 广州中科检测技术服务有限公司，广东广州 510650；2. 中国石油天然气股份有限公司玉门油田分公司物质采购管理中心，甘肃 玉门 735019）
作者简介：朱霄龙（1988~），男，学士；研究方向：化学化工、环境保护。

摘 要：对不同pH 值对L-抗坏血酸―赖氨酸/甲硫氨酸模型体系发生的美拉德（Maillard）反应所得到产物（MRPs）的抗氧化性活性的影响进行了研究。结果表明，MRPs的pH值在酸性条件下增大，在碱性条件下减小；在pH＝5时，其紫外吸光度、棕色指数、还原力和DPPH 自由基清除能力均达到最大；Fe2+螯合能力随着pH 值的增大而增大。因此可以得出结论：pH 值对抗坏血酸的MRPs 的抗氧化活性有较大影响，且在pH＝5时，抗坏血酸的Maillard反应产物的抗氧化活性最强。

关键词：抗坏血酸；赖氨酸/甲硫氨酸；Maillard反应产物；抗氧化性；pH值
中图分类号：O631.5 文献标识码：A
美拉德（Maillard）反应，最初是1912 年法国著名的化学家Maillard将甘氨酸与葡萄糖混合共热时发现并报道的，它又称非酶褐变反应，是指含氨基化合物（氨基酸等）与含羰基化合物（糖类）之间通过缩合、聚合而生成类黑精的反应[1]。抗坏血酸广泛存在于植物性食品（如水果蔬菜）以及动物食品（如牛乳和肝）中，它是一种关键的、无处不在的物质，在食品和饲料贮藏加工过程中，抗坏血酸有着重要的影响。Maillard反应通常是醛基化合物（大多是还原糖）与氨基化合物的反应，虽然抗坏血酸本身并没有醛基，但Maillard反应是热反应，抗坏血酸可热降解形成糠醛等醛基化合物，所以在食品化学中抗坏血酸与氨基酸的反应也属于Maillard反应[2]。研究抗坏血酸的Maillard反应比研究普通还原糖的Maillard反应具有更为重要的意义。近年来有关抗坏血酸的Maillard反应的研究报道很少。Yin[3-4]等报道了抗坏血酸与氨基酸反应可形成脂褐质样物质，这些物质可能是形成老年斑的重要原因。Obretenov 等[5]报道了抗坏血酸与甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸反应制备高分子量水溶性类黑精，用固相微萃取（SPME）研究其释放的乙酸异戊酯等的香味成分。Hartmann等[6]在谷氨酸钠、L-抗坏血酸、盐酸硫胺和胱氨酸的模型体系中研究水活度对主要肉香挥发性产物的影响。Kennedy等[7]在抗坏血酸的水溶液中分析碳水化合物和氨基酸及其在抗坏血酸的非酶棕色化中的作用。Rogacheva等[8-9]报道了抗坏血酸与氨基酸反应生成类黑精，并研究了抗坏血酸的棕色化行为。而关于其体系所生成类黑精的抗氧化活性方面的研究报道相对较少。本文主要研究不同pH 值对L-抗坏血酸与氨基酸模型体系的Maillard反应产物（MRPs）的抗氧化活性的影响，旨在为探讨抗坏血酸/氨基酸体系的Maillard 反应产物的抗氧化性活性提供科学依据。

1 实验
1.1 仪器和试剂
PHSJ-3F型pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；HH-2S型恒温水浴锅（上海仪器厂）；UV-2501 型紫外分光光度计（Shimadzu, Kyoto, Japan）；油浴锅（上海普渡生物科技有限公司）；800 型离心机（上海云楼医用仪器厂）；P170005 型耐压反应瓶（北京欣维玻璃仪器有限公司）；MWCO500型透析袋（武汉鑫思锐科技有限公司）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）。赖氨酸，甲硫氨酸（上海源聚生物科技有限公司）；L-抗坏血酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，铁氰化钾，三氯乙酸，菲洛嗪，氯化亚铁，三氯化铁，三氯乙酸（国药集团化学试剂
有限公司）；菲洛嗪，1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基（DPPH）（Sigma, St. Louis, MO, USA）。
1.2 Maillard反应产物的制备
将 0.176 1 g（1.0 mmol, 0.001 mol）L-抗坏血酸溶解于10 mL 0.20 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，再用固体NaOH 在pH计上调至相应pH值（分别由pH 5.8下调至pH 4.0，其它调节至pH 5.0、6.0、7.0、8.0），装入48 mL P160004 厚壁耐压反应瓶中，同时加入0.001mol/L的相应氨基酸，密封，在140℃下搅拌反应2 h，快速冷却至室温。然后用MWCO500透析袋透析至L-抗坏血酸的质量浓度≤1 mg/mL。定容至50 mL，置于4℃冰箱中保存备用。
1.3 pH 值的测定
用 PHSJ-3F型pH 计测定反应液的pH 值。
1.4 紫外吸光度和棕色指数的测定
根据文献[10]中的方法，取反应液1.0 mL，加入3.0 mL二次蒸馏水，分别在294 nm和420 nm下用1 cm光程长的吸收池测定其吸收度（A294和A410），用二次蒸馏水作为空白。以A294和A410为纵坐标、相应条件为横坐标做图。
1.5 还原力的测定
根据文献[10-11]中的方法并略加改动，取反应液0.50 mL，加入1.00 mL 0.20 mol/L的磷酸钠缓冲液（pH 6.6）和1.0 mL 1%的铁氰化钾，混匀，在50℃的水浴中加热10 min，然后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸。在室温下离心分离10 min，取上清液2.0 mL，加入1.0 mL去离子水和200 mL 0.1% FeCl3，静置5 min。用蒸馏水代替1%的铁氰化钾作为空白，在700nm处测定吸光度。用700 nm处测定的吸光度减去空白测定值来表示还原力的大小。
1.6 DPPH 自由基清除率的测定
根据文献[10-11]的方法并略加改动，取反应液0.5 mL，加入3.0 mL 0.12 mmol/L的DPPH甲醇溶液，剧烈混和均匀，在室温下（记录室温）避光静置30 min。以二次蒸馏水为空白，在517 nm处测定吸光度Asample(517nm)，并以3.0 mL DPPH 甲醇溶液加1.0 mL蒸馏水代替样品作为对照物测定吸光度Acontrol(517nm)。所有测定值均设二次重复，取平均值，测定温度控制在30℃以下。样品的DPPH 自由基清除率按下式计算：

1.7 Fe2+螯合能力的测定
根据文献[12]的方法并略加改动，取1.0 mL反应液加入2.0 mL dd H2O和0.05 mL 2.0 mmol/L的FeCl2，在室温条件下放置30 s，然后加入0.1 mL 5 mmol/L的菲洛嗪，室温放置10 min后在离心机上以3 000 r/min 的转速分离5 min，取上层清液，在562 nm 下测定其吸光度Asample(562nm)，空白用ddH2O代替反应液重复以上操作，在562 nm下测定其吸光度Ablank(562 nm)，样品Fe2+螯合能力用百分率表示，其计算公式如下：

1.8 统计与分析
试验数据采用Excel 2007、Origin 7.0 统计软件进行数据处理及统计分析。用One-wayAnova 或者T-test进行分析，以P＜0.05 为显著水平。
2 结果与讨论
2.1 抗坏血酸 Maillard反应产物的pH 值变化
从表1 中可以看出，赖氨酸在pH＝4～7 时MRPs 的pH 值相应增加，且随着pH 的增大其增长速度逐渐减慢，在pH＝8时产物的pH 值降低；甲硫氨酸在pH＝4～6 时MRPs的pH 值相应增加，且随着pH 的增大其增长速度逐渐减慢，在pH＝7～8时产物的pH 值降低。从表1 还可知，抗坏血酸的MRPs的pH 值在酸性条件下增加，在碱性条件下减小，而且抗坏血酸―赖氨酸模型的Maillard体系比抗坏血酸―甲硫氨酸模型的Maillard体系的产物抗氧化活性强。可能的原因是：1）抗坏血酸发生了降解，导致溶液中的酸性物质减少，pH 值上升；2）抗坏血酸降解的产物与氨基酸发生Maillard 反应生成了更弱的酸[3]，如2-糠酸，使得溶液pH 值在酸性条件和碱性条件下都趋向中性。

2.2 pH 值对紫外吸光度的影响
紫外吸光度（A294）表示了Maillard 反应的高级阶段通过糖裂解和Strecker 裂解等过程产生的酮、醛类等无色小分子中间体的吸光强度。由图1 可知，当pH＝5 时赖氨酸与甲硫氨酸的吸光度显著增加且达到最大，随着pH 值的升高，吸光度下降，当pH＝6～8 时，抗坏血酸的MRPs的吸光度略有下降且趋于平衡。结果表明：抗坏血酸的Maillard反应的中间产物在pH＝5 时生成量最大。

2.3 pH 值对棕色指数的影响
棕色指数（A420）通常用来表征Maillard 反应的褐变程度[10]。从图2 可以看出，在pH＝5 时两种氨基酸的MRPs 的吸光度显著增加且均达到最大，随着pH 值的升高，吸光度逐渐下降，最终趋于平衡。由此可知，溶液发生了褐变，且在酸性条件下褐变强度最强。产生这种现象的原因可能是：在酸性条件下，抗坏血酸发生了降解，其降解产物糠醛等显著地增加大棕色指数[13]。同时，抗坏血酸的降解产物与氨基酸发生了Maillard反应即褐变反应，这也可使实验测得的吸光度增加。
2.4 pH 值对还原力的影响
Maillard反应产物的抗氧化活性与还原力密切相关，其提供的电子与自由基反应，使自由基成为稳定的物质，从而阻断自由基的连锁反应[14]。测定的吸光度值越大说明其还原力越强。由图3可知，当pH＝5 时抗坏血酸的MRPs的吸光度显著增加且达到最大，随着pH值的升高，吸光度下降，当pH＝6～8时，抗坏血酸的MRPs的吸光度略有下降且趋于平衡。结果表明，抗坏血酸―赖氨酸/甲硫氨酸模型体系下MRPs 在pH＝5 时还原力最强。产生这种现象的原因是：反应生成了羟基[11]，而羟基在还原力中起主要作用。从以上结果中可以看出，不同pH 值下的MRPs的还原力与棕色指数密切相关。

2.5 pH 值对DPPH 自由基清除能力的影响
由图4可知，当pH＝5 时赖氨酸与甲硫氨酸的DPPH 自由基清除能力均达到最大，随着pH 值的升高，其吸光度下降，并趋于平衡。这是因为：1）从小分子角度看，Maillard反应除生成使食品产生褐变的类黑精外，同时产生多种使食品具有特殊香味的杂环类挥发性物质，杂环类化合物主要是噻吩（thiophene）、噻唑（thiazole）、噁唑（oxazole）、呋喃（urfnae）和吡嗪（pyraznie）等，Eiserich和Shibmaoto详细研究了Maillard反应中挥发性杂环化合物的种类和其抗氧化性能，结果显示在酸性条件下生成的噻吩、噻唑、噁唑、呋喃等有抗氧化能力，而在碱性条件下生成的烷基吡嗪没有抗氧化性[15]。因此当pH 增大时，DPPH 自由基清除能力逐渐下降。2）从大分子的角度看，抗坏血酸在酸性条件下降解产物的MRPs 比在碱性条件下降解的产物的MRPs的DPPH 自由基清除能力强。
2.6 pH 值对Fe2+螯合能力的影响
Fe2+通过Fenton 反应等作用阻碍铁离子催化的自由基链式氧化反应，从而达到抗氧化的目的。因此，螯合能力通常用来评价抗氧化剂潜在的抗氧化活性。由图5 可知赖氨酸和甲硫氨酸Fe2+螯合能力随着pH 的增大而增强。这说明随着pH值的上升Maillard反应产物的潜在的抗氧化活性也在增强。