ELISA实验的注意事项

1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

（1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。

（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

（4） 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如框应洗净烘干。

5. 准备实验时，预先让37度恒温箱升温至37度；样品和试剂盒在室温下平衡30分钟以上。

6. ELISA试剂盒固化的抗体在底部，加样时枪头千万不要碰到底部；用不完整个试剂盒可以分开用，但分时一定不要摸底部，原因同前。 

7. 每次孵育时用胶带封住酶标板口，防止水份蒸发。

8. 微孔板一般是一排8个，在其一端排头的边缘用记号笔标记下顺序（如1，2，3...），以免手工洗板过程中板朝下拍时不慎致微孔板掉出酶标板框而无法确认顺序。

9. 加标准品和样品时每次都要更换一个枪头，避免重复使用枪头而交叉污染。

10. 37度温育后千万不要忘记倒掉微孔板中的液体（包含未结合上的酶联亲和物，其残留必然造成假阳性），并且反复用稀释好的洗涤剂洗板。 

11. 应做预实验和标准曲线，如果多数样本测值在最高OD值处波动，要稀释后再重做，然后按稀释倍数算出来最终结果，因为试剂盒是有测试范围的。