西南大学973项目文章改进RNAi实验方法

ihpRNA构建过程

    构建hpRNA（hairpin  RNA）高效克隆和表达载体用于特定基因表达调控是RNAi技术应用研究的热点之一，来自重庆西南大学生物技术中心（Biotechnology  Research  Center,  Southwest  University）的研究人员就ihpRNA  (intron-containing  hairpin  RNA，含intron发卡结构RNA)构建方面提出了一种新颖的PCR介导的技术方法，这种ihpRNA构建体（construct）可以克隆进任何表达载体，为RNAi技术手段提供了新思路。这一研究报告发表在11月的“BioTechniques”上。

    领导这一研究的是来自西南大学生物技术中心的裴炎教授，以及肖月华和侯磊等，这一研究受到国家重点基础研究发展规划资助项目(973)  (No.2004CB117300  to  L.H.)和国家自然科学基金项目(No.30200177和30471055  to  Y.-H.X.)资助。

    基因沉默(gene  silencing)是转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象。一方面，基因沉默为利用遗传操作创造遗传修饰物种(genetically  modified  organisms，GMOs)造成障碍；另一方面，它又为研究基因功能及植物基因表达调控提供了新途径，即通过有选择地抑制特定基因的表达来创造功能缺失体。可利用反向遗传学方法进一步研究基因的功能，或直接利用创造的特殊性状变异体进行植物改良，同时在植物发育的不同阶段抑制特定基因的表达，对发育生物学研究也具有重要意义。  

    根据基因沉默发生的时期，基因沉默分为转录水平的基因沉默(transcriptional  gene  silencing，TGS)和转录后水平的基因沉默  (post-transcriptional  gene  silencing，PTGS)。前者通常与DNA甲基化有关，表现为mRNA不能正常合成，造成基因失活。有研究表明，外源基因较内源基因更易甲基化，但外源基因甲基化不表达不一定影响内源基因的表达。后者虽能合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。近年来随着转录后基因沉默机制的深入探讨，使人们能够利用它有目的地使特定基因降低表达或不表达，PTGS技术在功能基因组学和植物改良中显示出巨大的应用潜力。

    其中构建hpRNA高效克隆和表达载体用于特定基因表达调控是目前RNAi技术应用在植物研究的热点之一，当hpRNA载体导入植物体后，在转录过程中产生mRNA发卡结构，发卡茎部形成稳定的dsRNA诱导同源的内源基因沉默。如果在靶基因的反向重复序列间加入一段非编码序列，如intron，在植物体内转录形成含intron的发卡结构(intron  splicing  hpRNA，ihpRNA)，则可以沉默大约80%到100%的转化株（transformant），沉默效果与hpRNA相比可从58％提高到90％。

    为了方便获得ihpRNA构建体，目前已经有了几种包含有功能性内含子的通用载体，但是这些方法通常都需要通过长引物或者几轮restrictions和ligations的重复构建对目标基因进行扩增，因此急待一种方便有效的快速获得ihpRNA构建体的方法。

    在这篇研究报告中，西南大学的研究人员发展了一种新颖的ihpRNA直接PCR扩增的方法（directed  amplification  of  ihpRNA  ，DA-ihpRNA)，可以从基因组DNA中一管直接获得一个ihpRNA构建体，并且这种ihpRNA就像是正义或反义链基因一样可以克隆进任何表达载体。