免疫组化的操作方法与步骤

    免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

    按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次； 

7. 加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应； 

8. 梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

SP法

SP(streptavidin-perosidase)法即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。

1. 烤片，68℃，20分钟；

2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min；

3. 阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；

4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5min；

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗；

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3×5min；

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3×5min；

8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

Elivison二步法

1. 石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3min）。

2. 取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3min。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)

3. 每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3min。

4. 除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

5. PBS冲洗3×5min。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3min。

6. 除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5min

7. 除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。

8. 苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。