核磁共振技术与新药安全性评价

从药物研究和毒理学评价的角度来看，基因组学方法是观察给药后基因表达的改变，主要采用基因芯片技术。然而，基因调节/表达与系统的整体功能之间的关系在目前还很不清楚，主要是因为决大部分DNA是非编码的，而编码蛋白质的基因不能孤立地发挥作用，而是需要与其邻近的基因和非编码DNA一起才能发挥其功能。正式由于这个原因，人们才发展了蛋白质组学。蛋白质组学方法可以对由给药或其它病生理过程引起的细胞蛋白质组成变化进行半定量的测量。蛋白质组方法所采用的技术主要包括双向凝胶电泳和质谱技术。与基因组方法相比，蛋白质组方法较慢，且劳动强度较大。需要强调的是，虽然这些方法能够在很大程度上揭示毒理学机理，并且给出与疾病相关的新的生物标记物，却很难将这些发现与经典的毒理学指标相关联。原因很简单，因为目前的技术和方法不能对给药后反应的整个进程进行测量，也不能对生物整体的应答进行测量。因此需要发展一种新的方法来实时给出多器官生物整体的在体信息。基于NMR的代谢组学（metabonomics）方法可以满足这样的要求。

2．Metabonomics在药物毒理学研究中的应用

代谢组学的目的是要扩展和补充由基因组学和蛋白质组学方法得到的对生物异源物质应答的信息。其任务是定量测量生物体对病生理刺激或基因改变的动态多参数代谢反应，是研究药物毒性和基因功能的技术平台。这个概念是根据Nicholson小组近二十年来利用1H NMR技术研究生物体液、细胞和组织中多组分代谢组成的工作而提出的。在这些研究中，还利用了模式识别，专家系统和相关的生物信息学工具。

在许多情况下，药物通过与遗传物质直接作用而产生毒性，或通过诱导系统合成与药物代谢有关的酶，从而产生有毒的产物。在这种情况下，用基因组和蛋白质组学方法来评价毒性是有用的。然而，在生物异源物质有可能只在药理学水平上产生作用，因而可能不会影响基因的调节和表达。再者，显著的毒理学效应可能与基因的改变和蛋白质的合成完全不相关。因此，在许多情况下，从基因组和蛋白质组角度考虑到的反应可能不能预测药物毒性。但是，所有的由药物引起的病生理紊乱都会由于直接的化学反应，或通过与控制代谢的酶或核酸相结合而引起内源生化物质在比例、浓度、代谢通量等方面的失调。如果这种变化足够大的话，就会影响整个生物体的功能。生物体液中的代谢物是与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡，因此，生物体中由于中毒或代谢损害而引起的细胞功能异常一定会反映在生物体液成分的变化中。要检测血浆、尿液、胆汁等生物基质中的一些具有特殊意义的微量物质，选择合适的分析方法致关重要。高分辨1H NMR波谱就非常适合用来检测生物体液中的成分异常，因为该方法可以同时对所有的代谢物进行定量分析，而且不需要样品前期准备，对任何成分一样灵敏。虽然也可以采用如质谱等其它方法，但对不同成分离子化程度的差别会影响定量和检测的可靠性。NMR方法还可以有效地用来从组织萃取物或细胞悬液中找出异常的代谢物。还可以利用高分辨魔角旋转（HR-MAS）探头来检测完整组织中的代谢物组成。

由1H NMR谱检测到的生物体液中的内源性代谢物模式完全依赖于动物体内的毒素的类型。每一种类型的毒物都会在生物体液中产生特征的内源代谢物浓度和模式变化，这种特征给我们提供了毒性作用的机理和毒性位置的信息。右图所示为一系列尿样的1H NMR谱图，是大鼠经不同的毒物处理后得到的。每一张谱图只需几分钟的时间，是非常有效的。可以看出，不同毒素引起的代谢物变化是有特征性的。因为几乎所有的代谢物都有其特征的NMR谱，因而可以作为毒物引起的代谢变化的指纹图谱。利用NMR方法，人们已经成功地发现了许多新的器官特异相关毒性的代谢标记物。作为分析生物化学技术，NMR正是在这种探索性的工作上具有优势。

但是，生物体液的NMR谱图能够提供的生物标记物信息要远比我们所知的精细和丰富得多。谱图中所检测到的是数百种代表着不同代谢路径的化合物。正是这些对毒性损伤的代谢组层面上的信息才能很好地表征这种损伤。我们可以将NMR谱图想象成一系列的生物标记物“窗口”，也就是谱图中包含有与特定靶器官毒性相关的代谢物信号的区一个个区域。这些“窗口”反映了因器官机能失调的机理和位置不同而引起的代谢物模式和强度的变化。因而有可能从这些简单的NMR谱中得到许多疾病和中毒过程的诊断信息。能够最有效地研究这些复杂的、多参数数据的方法是利用模式识别（pattern recognition，PR）的1D和2D NMR代谢组学方法。

生物体液的1H NMR谱图的复杂性是妨碍我们从中得到有用的生物学信息的限制因素。即使是一张生物体液的1D 1H NMR谱图就可能含有几千条可分辨的谱线。我们可以将这样的谱看作是一个n维对象；这些维可以是每一种可以测量的代谢物的浓度或者就是谱峰强度的分布。这样，生物体液的NMR谱就给我们提供了一个n维代谢指纹图谱，而这种代谢物轮廓图的特征是与疾病或毒性作用相关的。因此，就可以使用计算机辅助的模式识别方法和专家系统方法来帮助阐释在各种实验性的中毒状态中得到的NMR数据。最简单的办法就是将NMR信号强度数据看作一个代谢物浓度或分泌速率的多样本数组。模式识别可以帮助我们利用NMR谱图来对样品进行归类（正常或非正常）；对靶器官毒性分类以及确定器官内的作用位点和作用机制；找出毒性作用的生物标记物；对这种效应的进程进行评估。

一种最有用的并且容易应用的模式识别方法就是主成分分析法（principal component analysis，PCA）。PCA是一种将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标(主成分)上的探索性统计分析方法，以便利用主成分描述数据集内部结构，实际上也起着数据降维的作用。主成分（PC）是由原始变量按一定的权重经线性组合而呈的新变量，这些变量具有以下性质：（1）每一个PC之间都是正交的；（2）第一个PC包含了数据集的绝大部分方差，第二个则次之，依次类推。这样，由头两个PC作图，就能够最好地代表数据集所包含的生物化学变化。这样的PC图能够直观地描述药物和毒素作用到器官之后，根据其毒性机理而表现出来的内在的集束行为。每一个样本在PC图上的位置纯粹由它的代谢反应所决定。在这种较简单的方法中，将从经具有未知毒性的化合物处理过的动物得到的样本与NMR产生的代谢物数据库进行比较，就可以确定它在PC图上的位置，从而确定其机理。

基于NMR的代谢组方法的基本步骤是，首先测得一系列NMR谱图，然后不用对谱峰进行指认，而是直接将谱图分解成250-1000个区域进行积分，得到积分强度；然后将这些简化了数据输入程序，利用PCA等方法进行分析，得到PC图。由处于相似病生理状态的动物得到的样本通常具有相似的组分，因此在PC图中处于相邻位置。

然而，在现实世界中，毒理学数据要复杂得多，因为损伤是随时间而变化的，所以由NMR检测到的代谢物轮廓图也是与时间相关的。这就需要建立更复杂的模型和专家系统来进行分析，才能得出正确的结论。这里就不再细述。

总之，代谢组学已经作为一种独立的技术被广泛应用于候选药物的毒性评价，还被几家制药公司纳入其药物研发方案中。许多生物化学、毒理学和临床化学的问题都可以用基于高分辨1H NMR的代谢组学来加以阐述。从生物体液的1H NMR谱图可以得到大量的代谢物数据，并由此确定毒性的靶器官，推导出毒性的生化机理，发现损伤的发生、发展和消失过程中的生物标记物。代谢组学还能提供生物体的代谢指纹图谱（“代谢型”，metabotype），因而可以应用于药物临床试验的设计以及对作为疾病模型的经过基因修饰的动物的评价。应用代谢组学还可能设计出用于疾病诊断的生化试验方法，确定与疾病相关的生物标记物，并将其用于临床试验中药物功效的监控。该方法的应用范围将随着仪器和技术的发展而扩大。特别是用于数据分析的计算机辅助的模式识别和专家系统的发展，将会对此产生巨大贡献。