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国自然研究热点—外泌体介绍II

爱必信(上海)生物科技有限公司2024年1月23日 10:28 点击:278

背景:

 

外泌体是细胞分泌的一类具有细胞间通讯作用的细胞外囊泡,已被证明外泌体中包含了大量的脂质、蛋白质、酶、核酸等生物活性物质。其中的微小RNA (microRNA,miRNA) 是外泌体中最具代表性的,也是目前研究最多的核酸。miRNA是18-25个核苷酸的非编码小RNA分子,它可以通过与靶mRNA的3’非翻译区或开放阅读框区域结合而介导转录后基因沉默,在细胞增殖、分化、迁移及疾病发生和发展等过程中发挥重要调控作用。

 

miRNA的生成:

 

miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成长度约为几千个碱基的初级miRNA (pri-miRNA) 。pri-miRNA在蛋白复合物Drosha-DGCR8的作用下被加工成具有茎环结构的前体miRNA (pre-miRNA) ,pre-miRNA在转运蛋白的协助下从核内转运到细胞质中。在细胞质中,pre-miRNA被Dicer-TRBP识别,并通过对茎环结构的剪切和修饰,形成双链成熟的miRNA,但其中一条链迅速降解,另一条链被转载进AGO2蛋白中,形成RISC(RNA诱导沉默复合体),最终生成成熟的、具有功能单链miRNA。

 

单链miRNA与靶miRNA转录物相互作用,从而导致基因表达的抑制。


图 外泌体miRNA分泌机制

 

miRNA的特性:

 

1、高度保守性:miRNA保守性具有重要的生物学意义,提示在不同生物发育过程中,miRNAs具有相同的调控机制;

2、组织表达特异性:一些miRNA表达具有细胞和组织特异性;

3、时序表达特异性性:在不同组织、不同发育阶段,miRNA的表达水平有显著差异,miRNA表达是动态调控的。

 

miRNA的功能:

 

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。但这些miRNAs调节了细胞生长,组织分化,因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析,显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明:miRNAs在细胞生长和凋亡,血细胞分化,神经元的极性,胰岛素分泌,大脑形态形成,心脏发生,胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。对于新的miRNA基因的分析,可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子,促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。

 

miRNA检测方法:

 

考虑到miRNAs在基因调控和生物学功能中起到的关键作用,对miRNAs的特异性和敏感性检测变得越来越重要。传统的针对miRNA的检测有Northern blotting、微阵列分析和定量聚合酶链反应 (qPCR) 。

 

1、Northern blotting

 

Northern blotting是检测miRNA的标准和最广泛使用的方法。它不仅可以用于成熟miRNA的检测,还可以用于其前体的检测。其基本原理是将RNA样品用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳分离,根据其在凝胶中的位置变性并转移到硝化纤维素膜或尼龙膜上,固定后与同位素或其他标记探针反应。洗净游离探针后,可以通过放射自显影或其他合适的技术检测miRNA。Northern blotting可以检测到miRNA的相对分子大小和相对丰度,但也存在半定量、低通量、繁琐、耗时、RNA易降解等缺点。

 

2、微阵列分析

 

微阵列分析是快速、高通量检测miRNA最广泛使用的方法。该方法原理是使用标记探针通过反转录产生样品RNA,使用与目标miRNA具有相同序列的固相寡核苷酸检测这些荧光团或生物素标记的cDNA。将标记的cDNA样品装入每个孔中,然后进行一系列洗涤步骤以去除游离DNA。如果杂交的cDNA被生物素化,链霉亲和素标记的荧光团就可以被标记;如果用荧光团标记cDNA,则可以直接测量每个孔的荧光强度。每个孔的荧光强度可以用来确定miRNA的表达水平。虽然微列阵芯片针对的样本数量很多,但是成本也非常高。另外太短、低拷贝数的miRNA无法被检测到。

 

3、qPCR

 

qPCR因其动态范围大、灵敏度高、序列特异性高,已成为检测miRNA表达的常规可靠技术。首先通过逆转录反应将目标miRNA合成为cDNA,然后进行qPCR检测。要进行miRNA逆转录,需要对miRNA分子进行加长改造,一种方法采取的是进行Poly (A) 加尾,另一种采取的茎环法进行加长。监测miRNA的qPCR方法有两种:TaqMan探针法和SYBR Green荧光染料法。

 

miRNA定量全套实验步骤:


图 miRNA qPCR解决方案

 

从各类样本中提取miRNA,根据miRNA数量选择不同逆转录方法合成cDNA(如何选择miRNA逆转录方法见),最后进行miRNA定量。我们推荐从miRNA提取到逆转录、定量需要要配套的试剂盒。

 

一、miRNA提取

 

* 以血清血浆样本为例进行介绍(血浆血清miRNA提取试剂盒,abs60264

 

1、实验前处理;

1.1 实验前自行准备:无水乙醇、1.5mL RNase-free灭菌离心管。
1.2 取出洗涤液,按以下操作:
a)洗涤液A:按终浓度30%的比例加入无水乙醇,如7mL加入3mL无水乙醇;14mL加入6mL无水乙醇,充分混匀。
b)洗涤液B:按终浓度85%的比例加入无水乙醇,如1.5mL加入8.5mL无水乙醇;3mL加入17mL无水乙醇,充分混匀。
* 配制好的洗涤液如出现沉淀,可在37℃溶解,摇匀后使用。

 

2、取无RNA酶的1.5mL离心管,加入200μL样本,200μL miRNA释放剂及20μL消化液,充分混匀,65℃水浴10min;
3、加入5μL miRNA富集剂,0.85mL无水乙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响RNA的提取与后续实验;
4、将吸附柱放入收集管内,将650μL上述溶液转入吸附柱内,12000rpm离心1min,弃收集管内废液;将剩余溶液转移至吸附柱内,12000rpm离心1min,弃收集管内废液;
5、将吸附柱放回收集管内,加500μL洗涤液A至吸附柱内,静置2min,12000rpm离心1min,弃收集管内废液;
6、将吸附柱放回收集管内,加500μL洗涤液B至吸附柱内,静置2min,12000rpm离心1min,弃收集管内废液;
7、将吸附柱放回收集管内,加500μL洗涤液B至吸附柱内,12000rpm离心1min,弃收集管内废液;
8、按每份样本30μL取洗脱液(如10份提取样本,即取300μL洗脱液),放置于灭菌1.5mL离心管,65℃预热;
9、将吸附柱放回收集管内,12000rpm离心2min,离去残留的洗涤液;
10、取出吸附柱,放入新的1.5mL RNase-free灭菌离心管内,开盖,室温放置2min;
11、在吸附柱中心加入30μL预热洗脱液,静置2min,12000rpm离心1min,收集miRNA溶液。提取的miRNA即可用于下一步实验或-70℃保存。

 

二、miRNA逆转录

 

* 以加尾法为例进行实验步骤介绍,血浆miRNA加尾法逆转录试剂盒(abs60266

 

1、RNA加A尾

 取RNase-free离心管,配制如下混合液:RNase free ddH2O to 20μL 、Poly A 1μL、2xPoly A Buffer 10μL、RNA 5~9μL轻轻混匀,37℃ 30min,迅速置于冰上。


2、RT反应液配制:

上述反应液在使用前5000rpm离心5s:取上述反应液8μL、2x RT Buffer 10μL、 RTase Mix 2μL用移液器轻轻吹打混匀。


3、RT反应:

25℃ 5min、50℃ 15min、85℃ 5min反应完毕后,5000rpm离心5s,尽快放于冰上,直接进行PCR反应。如暂时不用,请放置于-20°C以下温度,在半年内使用完毕,不要反复冻融。模板如具有复杂二级结构或高GC区域,可将反应温度提高至55℃。

 

三、miRNA qPCR

 

* 逆转录选择加尾法,qPCR反应选择配套的加尾法qPCR试剂盒,miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂盒(abs60271

 

1、配制反应体系

 

取RNase-free离心管,配制如下混合液:

2× miRNA SYBR Mastermix

10uL

Specific Primer(10uM)

0.4uL

Tag Primer(10uM)

0.4uL

Temlate DNA/cDNA

2.0uL

ddH2O

to 20uL

 

* a)Specific Primer指miRNA的上游特异性引物,即由本公司设计的正向引物,一般标注为:xx-miR-X-X-F,该引物可自行设计合成,本公司也可免费提供设计;若使用U6作为参照时,Specific Primer标注为U6-Forward Primer。


* b)Tag Primer为本公司专用miRNA反向引物,若使用U6作为参照时,Tag Primer标注为 U6-Reverse Primer。


2、设置反应程序

 

激活Taq

95℃ 5min

PCR循环

95℃ 10S;60℃ 30S;40循环

熔解曲线

95℃ 15S;60℃ 1min;95℃ 15S;1循环

 

* 仪器类型不同,熔解曲线采集程序不同,使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。

 

3、检测及结果分析

 

在适当的qPCR仪器上完成实验,并分析结果。

 

FAQ:

 

1、miRNA逆转录&qPCR方法有哪些?

 

加尾法(常用,一次可以检测多种miRNA,非常加方便);

茎环法(常用,一次只能检测一种miRNA,但是特异性高);

探针法(较上面二种方法用的会相对少一些,特异性、灵敏度最高)。

 

2、miRNA逆转录加尾法与茎环法的具体区别?

 

1)加尾法:

对所有的miRNA都进行polyA加尾,选用通用的逆转录引物,把所有的miRNA都进行逆转录,逆转录的产物可以分别用于各个miRNA的qPCR的反应。一般如果检测的miRNA数量比较多的话,比较推荐加尾法做,因为一次性可以逆转录很多miRNA。(例如要检测5种miRNA,就选加尾法,买一套试剂盒就能同时测5种)

 

2)茎环法

对每个miRNA进行单独逆转录,每个miRNA都要有特异的逆转录引物,同时qPCR引物也是特异的,所以它的特异性比加尾法高,但是一次只能测一种miRNA。当miRNA数量不多,选茎环会比较好。(例如要检测1-2种miRNA,并且追求特异性,就选茎环法。)

 

3、miRNA逆转录和miRNA q-PCR一定要配套使用吗?

 

是的,因为逆转录试剂盒和q-PCR试剂盒里面有成分相互关联,不能分开使用,所以买逆转录就一定要买对应qPCR试剂,并且我们还免费设计引物。

miRNA茎环法逆转录配miRNA茎环法qPCR;

miRNA加尾法逆转录配miRNA加尾法qPCR;

miRNA探针法逆转录配miRNA探针法qPCR。

 

4、哪种miRNA逆转录&qpCR选择哪种方法价格便宜呢?

 

选择加尾法还是茎环法,具体是看具体实验需求,不能以价格来选择;

加尾法:一套试剂盒价格虽然贵些,但它一次能测多种miRNA,所以样本量多的情况下价格又便宜了;

茎环法:一套价格便宜,但是一次只能测一种,如果再测第二种第三种,又要重新设计引物,买试剂盒,总价格就高了。

 

5、miRNA引物怎么送?

 

免费设计1个miRNA引物,比如需要5个miRNA的引物,那么可以送其中一种,其余4种不送,需要定制合成购买,需要按照要求发送引物的目的基因。

 

6、关于miRNA引物合成,需要给什么信息?

 

需要发送引物的目的基因,也就是miRNA名字、ID号、序列,其中miRNA的名字和序列最重要,目的基因需要客户自己去查询确定;

一般引物信息格式如下:hsa-miR-22-3p AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU。

 

7、引物哪些在试剂盒里,哪些不在试剂盒中?U6分别是几条?

 

加尾法一套:

miRNA加尾法逆转录(逆转录引物,通用的,在试剂盒里面);

miRNA加尾法qPCR(送上游引物,是特异性引物,要单独设计,不在试剂盒里面;下游引物,是通用引物,在试剂盒里面);

U6内参:2条(不送,不在试剂盒里面,需要客户自己准备);

定量U6-F(指U6上游);定量U6-R(指U6下游)。

 

茎环法一套:

miRNA茎环法逆转录(送茎环引物,是特异性引物,要单独设计,不在试剂盒里面);

miRNA茎环法qPCR(送上游引物送,是特异性引物,要单独设计,不在试剂盒里面;送下游引物,是通用引物,在试剂盒里面);

U6内参:3条(不送,不在试剂盒里面,要客户自己准备。因为茎环法是特异的,所以它的U6也是要单独设计一套);

U6-NZL(指U6的逆转录);U6-F(指U6的上游);U6-R(指U6的下游)。

 

探针法一套:

探针法逆转录(逆转录引物混在Taqman buffer里);

探针法qPCR(上游+下游+探针,混在primer mix里,不是独立的管子);

U6内参(不送,U6上游+U6下游+探针,混合在一个管子,需要客户自行购买)。

 

8、U6内参是什么?

 

内参是在各类细胞中普遍存在的一个基因,用于排除由于加样量差异导致的误差。做miRNA逆转录和qPCR实验过程中是需要内参的,客户一般会选择合适的基因作为内参,不一定非要选择U6。但一般都是以U6内参为主,它是最常用的。

 

9、可以发送试剂盒引物序列吗?

 

miRNA引物的序列公司这边是保密的。如果客户需要发表文章必须要用到的情况下可以提供,但是前提是需要客户在文献里写明:设计与合成来自爱必信(上海)生物科技有限公司,并附上产品货号。

 

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参考文献

[1] Yu X, Odenthal M, Fries JW. Exosomes as miRNA Carriers: Formation-Function-Future. Int J Mol Sci. 2016 Dec 2;17(12):2028. doi: 10.3390/ijms17122028. PMID: 27918449; PMCID: PMC5187828.

[2] Ye J, Xu M, Tian X, Cai S, Zeng S. Research advances in the detection of miRNA. J Pharm Anal. 2019 Aug;9(4):217-226. doi: 10.1016/j.jpha.2019.05.004. Epub 2019 May 25. PMID: 31452959; PMCID: PMC6702429.

[3] 刘念,张国军,姚群峰.外泌体miRNA及其作为肿瘤分子标志物的研究进展[J].检验医学与临床,2021,18(03):417-420.

[4] Yan S, Jiang Y, Liang C, Cheng M, Jin C, Duan Q, Xu D, Yang L, Zhang X, Ren B, Jin P. Exosomal miR-6803-5p as potential diagnostic and prognostic marker in colorectal cancer. J Cell Biochem. 2018 May;119(5):4113-4119. doi: 10.1002/jcb.26609. Epub 2018 Jan 25. PMID: 29240249.

[5] Huang Y, Zou Q, Wang SP, Tang SM, Zhang GZ, Shen XJ. The discovery approaches and detection methods of microRNAs. Mol Biol Rep. 2011 Aug;38(6):4125-35. doi: 10.1007/s11033-010-0532-1. Epub 2010 Nov 25. PMID: 21107708.


(来源: 爱必信(上海)生物科技有限公司


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