D-荧光素钾盐/钠盐体外操作手册
- 北京启维益成科技有限公司2014年8月21日 16:19 点击：1759
注：以下翻译仅供参考，最终使用者请以英文原文说明书为准！！
介绍
荧光素是一种常用的荧光素酶表达的活体成像生物发光报告子。以ATP和Mg2+作为辅因子，有氧条件下荧火虫荧光素酶与水溶性底物反应发出一种特有的黄绿色发射光，在37℃活体内转换为红光。该反应通过消耗ATP来指示是否存在能量或生命的存在。
由于萤火虫荧光素酶的超灵敏性，快速和易于使用的体系，在研究基因表达方面萤火虫荧光素酶是最常用的报告基因之一。荧光素酶被用来监测细菌，培养细胞和转基因植物或动物的启动子活性反应。荧光素酶是一个61kDa大小的蛋白，它的活性形式是单体，且不需要其它的加工修饰。通过催化荧光素的氧化羧化作用，萤火虫荧光素酶会产生已知的生物发光中最高效的反应之一。荧光素酶活性用来描述与启动子/增强子元件相联的基因调控。通过优化，化学发光反应产生的光和调控元件的转录活性之间存在直接相关性。
对于体外报告系统荧光素酶活性的检测，此手册将提供一个简单的，经济可靠的方法。
生物发光反应
几个因素将会影响反应的灵敏度，包括温度，pH或底物浓度。为得到最佳结果，在使用之前我们建议用pH7.8的缓冲液，并且所有试剂在室温下预热。为充分反应，我们建议在分析缓冲液中加入过量的ATP和Mg2+。
当荧光素加入到荧光素酶样品中，会看到瞬间闪光在0.3-0.5秒内达到峰值强度。这光将随着半衰期0.5-1.0分钟左右很快消失。但是初始如果在分析buffer中加入辅酶A，将能阻止快速反应延长半衰期至2-5分钟。如果在反应混合液中后加辅酶A，将促进额外的，次级发光（Fraga, 2008）。
在Gold Bio，我们建议用以Yuichi Oba, et al. (2003)为基础的荧光素酶分析buffers：
-100mM Tris- HCl(pH7.8)
-5mM MgCl2
-250 uM CoA
-150 uM ATP(Fraga, 2008)
-150 ug/ml d-Luciferin(启维益成)
一些研究者在分析buffer中也加入其它成份，比如DTT或EDTA(Steghans, 1998)。根据您具体需要可以适当调整分析buffer。为得到最佳结果，根据您具体细胞我们建议先做一个动力学曲线的初步测试。
产品具体信息
D-荧光素钾盐
4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
KC11H7N2O3S2
分子量：318.42 g/mol
D-荧光素钠盐
4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt
NaC11H7N2O3S2.H2O
分子量：320.32 g/mol
储存：-20℃避光保存。
材料
l D-Luciferin salt for GoldBio Luciferin Stock Solution(GLSS)
荧光素钾盐（启维益成, G156410）
荧光素钠盐（启维益成,G156411）
l GoldBio Luciferase Assay Buffer(TMCA)
Tris-HCl, pH7.8
MgCl2
Coenzyme A(CoA)(hydrate)
ATP(disodium salt hydrate)
GLSS(GoldBio luciferin Stock Solution)
l PBS(不含Ca2+或Mg2+)
l 细胞裂解buffer
l 荧光素酶（对照）
GoldBio 荧光素储备液（GLSS）的制备
1. 用分子生物学级水配成15mg/ml（100×）荧光素储备液
a. 为最佳结果，荧光素储备液最好现配现用，但如果分成小份储存在-80℃可最长保存一个月。
2. 在荧光素酶荧光分析中荧光素底物的终浓度应该是：150ug/ml（471uM荧光素钾盐或468uM荧光素钠盐）
GoldBio 荧光素酶分析buffer（TMCA）制备
与TMCA混合之前用分子生物学级水制备所有试剂储备液
1. 制备500mM MgCl2（100×）溶液
a. 称取476.05mg（95.21g/mol）的MgCl2，溶于10ml水中。
b. 溶液储存于室温。
2. 制备25mM CoA(100×)溶液
a. 称取191.88mg（767.53g/mol）辅酶A并溶于10ml水中。
b. 用5-10ml水先预湿0.2 um滤膜。
c. 通过预湿的滤膜滤灭100×辅酶A并存于-20℃。
3. 制备15mM ATP（100×）溶液
a. 称取82.67mg（551.14g/mol）ATP并溶于10ml水中。
b. 存于-20℃。
4. 制备400mM Tris-HCl, pH7.8(4×)buffer
a. 称取4.85g（121.14g/mol）Tris碱并溶于85ml水中。
b. 用1M的HCl调pH到7.8然后定容到100ml。
5. 室温下制备新鲜的2×TMCA工作液
a. 计算出实验所需要的TMCA，然后用水混合所有的成份到2×工作浓度（在荧光素酶分析buffer中随后稀释到1×）
比如：1ml TMCA(2×):
500ul Tris-HCl（4×储备液）
20ul MgCl2（100×储备液）
20ul CoA（100×储备液）
20ul ATP(100×储备液)
用水定容至1ml。
b. 如果必要可同时另加其它成份（比如DTT, EDTA）。
GoldBio 细胞裂解buffers
为满足客户需求Goldbio最近提供一系列裂解buffers。下面的buffers如果您有什么问题请联系我们获取更多的信息。
l 细菌细胞裂解buffer（启维益成，G176415/G156285）
l 哺乳动物细胞裂解buffer（启维益成，G176416）
l 组织培养裂解buffer（启维益成，G156287）
l 酵母裂解buffer（启维益成，G156286/ G176417）
为荧光素酶提取之细胞裂解制备
贴壁细胞（单层）vs. 非贴壁（悬浮细胞）培养
对于细胞培养有两个基本体系，一个是单层培养（贴壁的），一个是悬浮培养（非贴壁的）。大部分动物来源的细胞都是贴壁依赖型（造血干细胞或相似细胞系除外）并且需要有一个适合的能够轻易地使细胞附着的培养器皿（经常被称为细胞培养改性处理）。但也有很多细胞系用悬浮培养的方法。悬浮培养不需要经过改性处理，但是培养基必须被搅拌来获得充足的气体交换从而避免细胞死亡。每天监测悬浮细胞数量来确定细胞生长情况和密度。稀释悬浮细胞培养物来刺激细胞生长。
对于贴壁细胞培养，每天用倒置显微镜监测以确定细胞覆盖。大部分贴壁细胞达到80-90%的细胞覆盖应继代培养一次以避免营养消耗和细胞死亡。贴壁细胞总是需要组织培养器皿改性处理来获得适当的附着和生长。根据细胞培养目的也可以用玻璃器皿代替一次性塑料培养板，但是保证所有的去污剂残留被清除是必须的，并且使用之前应该被灭菌。不同的细胞系贴壁程度是不同的，但大部分情况下，用胰蛋白酶（或其它的蛋白酶）来释放细胞。有些细胞系可能不适合用蛋白酶（比如当蛋白酶对细胞是有害的或当它们是感兴趣的膜标志物或受体）。为了易于从培养板或培养皿上分离细胞，细胞刮应带一部分体积的悬浮培养基带进细胞。
为分离贴壁细胞：
（依据-分子生物学，vol. 290: 基础细胞培养手册）
1. 从已经达到理想的细胞覆盖的培养皿中吸出培养基，用2-3ml RT PBS（不含Ca2+或Mg2+）洗单层细胞以洗去所有生长培养基残留物。
2. 吸出PBS然后加入3-4ml RT 胰蛋白酶-EDTA(T/E)。37℃孵育3-5分钟。用倒置相差显微镜监测培养物生长进展。
3. 细胞一旦分离下来，转移含6-7ml培养基（包含足够的血清抑制胰蛋白酶活性）的细胞到离心管中进行离心。为了从培养皿中获得所有细胞，用5ml的细胞/培养基混合物冲洗培养皿一到两次然后把悬浮细胞液加入初始的用胰蛋白酶处理的细胞中。
4. 用血细胞计数器对细胞进行计数并继续裂解步骤。
Note：细胞裂解之前应该被离心并冲洗（参看下面）
真核细胞裂解（哺乳动物或酵母）
（改编自GoldBio的哺乳动物细胞裂解buffer手册或酵母/真菌细胞裂解buffer手册）
使用之前配制：根据应用，可能加入DTT和EDTA。制备适量的细胞裂解buffer（哺乳动物或酵母）加入DTT和EDTA使终浓度为5mM。如果体系中的二价金属离子是反应必要的，则不加EDTA，而是用合适的二价盐使终浓度成为5mM。
蛋白酶抑制剂—在提取过程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制剂来抑止蛋白酶活性（参看ProBlockTM Gold 哺乳动物蛋白酶抑制剂，启维益成，G156290，或ProBlockTM Gold 酵母/真菌蛋白酶抑制剂，启维益成，G156292）。
哺乳动物
1. 细胞在200-500×g条件下离心5分钟，移取并弃上清液。对于贴壁细胞，从培养板上刮或分离细胞（参看上面：“分离贴壁细胞”），离心并弃上清。
2. 用5-10ml PBS（不含Ca2+或Mg2+）洗细胞，然后移去上清，轻轻拍打离心管壁让细胞变得松弛，再用5-10ml PBS来回吸吐进行重悬。再次离心。
3. 移取并弃去PBS洗液。
4. 在剩余的PBS洗液中轻轻吸吐重悬细胞。加入哺乳动物裂解buffer悬起细胞。每10ml生长良好的悬浮培养物，加大约1ml哺乳动物裂解buffer。
或者：每0.05g湿的细胞加1 ml哺乳动物裂解buffer。获得浓缩的细胞提取物，减少哺乳动物细胞裂解buffer。这种情况下，冻融一次可确保细胞完全裂解。
5. 用移液枪头混匀细胞直到成为匀一的悬浮液为止。在冰上孵育15-30min。不时地翻转混匀悬浮液以便裂解充分。
注意：冻融步骤并不是裂解所必须的。一次或两次冻融对细胞是没有伤害的，但可以确保细胞完全裂解。
6. 在冷冻离心机里20,000×g离心悬浮液30分钟，收集上清液并分析。
注意：细胞残留物中可能含有核膜结合蛋白，这可能需要不同的去去污剂来进一步提取。
酵母
1. 200-500×g离心酵母细胞（OD6001.5-2.0）5-10分钟，在等体积的酵母悬浮buffer中悬浮细胞。每100ul酵母悬浮细胞加1ul β-巯基乙醇。
2. 轻轻地吸吐细胞悬浮液直到成匀一状。在4℃下孵育5分钟。再轻轻地吸出悬浮细胞。
3. 加入ZymolyaseR (裂解酶)轻弹以混匀溶液。每100ul细胞悬浮液加入10ul裂解酶，轻轻地混匀。
4. 37℃孵育30-60分钟，取25ul悬浮液与1ml酵母裂解buffer混匀，然后读取OD800的吸光度值。
5. 孵育结束，1,500×g离心5分钟，小心弃上清，留原生质球在离心管中。
可选择：加5-10ul酵母悬浮buffer到原生质球中，轻拍离心管重悬菌体。按照上面的步骤离心然后弃上清。
6. 裂解：在适当体积的酵母裂解buffer（菌体体积的2-3倍）中悬浮酵母菌体。轻轻吸吐菌体来回几次。冰上孵育30分钟并不时地翻转。在37℃下孵育1-3分钟或短暂超声步骤可能更有助于裂解。对于剪切基因组DNA来说超声是必要的。请注意：对酵母菌体得率，越多的酵母裂解buffer，细胞裂解的越好。
7. 20,000×g 4℃离心30分钟，收集裂解物，下游分析备用。
注意：额外的酵母裂解buffer可另购作下游分析用。比如色谱分析或透析等。
l ZymolyaseR是Kirin Brewery Co. Ltd.的注册商标。
细菌细胞
（修改自GoldBio的细菌细胞裂解buffer操作手册）
使用前制备：根据应用，可能加入DTT和EDTA。制备适量的细菌细胞裂解buffer加入DTT和EDTA使终浓度为5mM。如果体系中的二价金属离子是反应必要的，则不加EDTA，而是用合适的二价盐使终浓度成为5mM。
蛋白酶抑制剂-在提取过程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制剂来抑止蛋白酶活性（参看ProBlockTM Gold 细菌蛋白酶抑制剂，启维益成 ，G156289）。
蛋白提取同时去除核酸
1. 把培养好的OD600为1.5-3.0的细菌细胞以200-500×g条件下离心10分钟，用5-10ml的细菌裂解buffer悬浮细胞（比如25ul的细胞菌体用125-250 ul细菌裂解buffer）。
2. 轻轻吸吐悬浮细胞直到成均一状。在冰上或4℃孵育5分钟。再轻轻吸出然后悬浮。
3. 旋涡振荡包含裂解酶的冰冻悬浮液离心管。在细菌裂解buffer中第100ul细胞悬浮液加5ul裂解酶，轻轻混匀。
4. 在37℃孵育悬浮细胞30-60分钟。
可选择—取25ul悬浮液并与1ml细菌细胞裂解buffer混匀并读取OD590吸光度值来监测细胞裂解程度。
5. 孵育期间，翻转离心管来回几次助于细胞充分裂解。用一个小量程移液枪来回吸吐悬浮液或用一个20-gauge的注射器针头将更有助于细胞裂解。
注意—额外体积的细菌裂解buffer用作下游分析可另购比如色谱分析或透析等。
6. 去除DNA--裂解期间，细胞DNA和RNA应被分开这样可降低裂解物的粘性。一些DNA碎片可能存在但不会干扰下游过程。然而，为完全去除核酸，在细菌裂解buffer中不要加入EDTA，完全裂解后，再加入EDTA使终浓度成为2.5mM。
7. 4℃以20,000条件下离心裂解物30分钟，并收集裂解物以备下游分析。
蛋白质提取与原生质球形成
溶菌酶污染是不可接受的。用以上细菌蛋白提取方法步骤1-4，然后：
5. 孵育之后，200-500×g条件下离心10分钟。小心移弃上清液，留原生质球于离心管中。
可选择—在5-10ml细菌悬浮buffer中重悬原生质球。按照上面的步骤再次离心并弃上清。
6. 裂解：在适当体积的细菌裂解buffer（2-3倍体积的原生质球）中重悬原生质球。重复吸吐悬浮液几次。冰上孵育30分钟并不时地翻转。在37℃孵育细胞1-3分钟或短暂超声更有助于细胞裂解。请注意，就原生质球得率而言，细菌裂解buffer越多，细胞裂解的越充分。
7. 4℃ 20,000×g离心裂解物30分钟并收集裂解物以备下游分析。
包涵体的分离：对于分离包涵体，裂解步骤之后，4℃ 30,000×g离心细菌裂解物30分钟，收集包涵体并用10倍液的细胞裂解buffer洗两次（在buffer中悬浮并离心收集包涵体）。收集包涵体溶解并浓缩。
荧光素酶标准曲线
为计算样品中荧光素酶的绝对含量（如果需要的话），根据您的光度计做光检测的线性范围是非常必要的。光度计在高光密度下会信号饱和。为光度计做线性范围：
1. 在1×裂解buffer（或在纯化荧光素酶的PBS buffer中）中设置一系列稀释的荧光素酶含1mg/ml的BSA（可以用细胞培养裂解物或纯的荧光素酶）（BSA有助于荧光素酶的稳定性）。
a. 为检测背景荧光也可包括不含荧光素酶的样品(作为阴性对照)
纯化的荧光素酶储存液：在100mM Tris-HCl pH7.8/ 5mM MgCl2中溶解1mg荧光素酶，分成等份儿冰冻于-20℃或与100%甘油混合然后储存于-20℃（甘油储存将不会结冰）。冰冻的荧光素酶储存液和荧光素酶甘油储存液在-20℃至少保存两年仍有活性。
2. 加100ul 2×TMCA（1×终浓度）到比色皿中或96孔板中。
3. 每个样品中加2ul 100×GLSS（1×终浓度）
4. 加98ul稀释的荧光素酶储存液或裂解物到比色杯中或板子中。避光（这样利于荧光稳定对于制作标准曲线更准确）室温下孵育5-10分钟。
a. 为取得最佳结果，读数之前每个样品的孵育时间应该一致。
b. 注：这个体积是按照加入100×GLSS，终浓度为1×TMCA来计算的，不同的总体积，要相应地重新计算反应混合液。
5. 用光度计记录光密度值。
6. 产生荧光素酶标准曲线并计算出光产量vs. 细胞数量（或vs.ug 荧光素酶）。
注：如果按照上述步骤没有产生一个合适的线性轮廓图，您可以调整荧光素的浓度（通常降的更低）
荧光素酶荧光分析
荧光素酶荧光分析很大程度上依赖于光度计（是否是手动的，单通道注射或整板读的光度计）。关于您具体的光度计跟它的注射容量和编程指令有关（注：GLSS浓度根据不同光度计的注射体积不同需要做适当的调整）。
分析反应混合液时，TMCA的终浓度应该是1×。GLSS和裂解物的体积应根据最终TMCA体积来调整。
例1：手动光度计（200ul 终反应体积）
1. 吸取100ul TMCA到一个干净的比色杯中。
2. 吸取50-98ul 裂解物到比色杯中。
3. 如果必要用水把体积定容至198ul。
4. 吸取2ul GLSS（1×终浓度）并在光度计上立即读取数据。
例2：注射光度计（单一样品或整板）（200ul终反应体积）
1. 吸取100ul TMCA到光度计比色杯中或96孔板的每孔中（白色固体的，平底板最好）。
2. 吸取50-98ul 裂解物到比色杯或孔中。
3. 如果必要用水把体积定容至198ul。
4. 需要2-5秒钟用程序指令光度计注射GLSS后在随后的10秒钟检测。
文献：
1. Seliger, H. H., &McElroy, W. D. (1960). Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. Archives of biochemistry and biophysics, 88(1), 136-141.
2. Fraga, H. (2008). Firefly luminescence: A historical perspective and recent developments. Photochmeical & Photobiological Science, 7(2), 146-158.
3. Oba, Y., Ojika, M., & Inouye, S.(2003). Firefly luciferase is a bifunctional enzyme: ATP-dependent monooxygenase and a long chain fatty acyl-CoA synthetase. FEBS letters, 540(1), 251-254.
4. Steghens, J. P., Min, K.l., & Bernengo, J.C. (1998). Firefly luciferase has two nucleotide binding sites: effect of nucleoside monophosphate and CoA on the light-emission spectra. Biochmeical Journal, 336(pt 1), 109.
5. Helgason, C.D. and Miller, C.L. (2005). Methods in Molecular Biology, vol. 290: Basic Cell Culture Protocols, Third Edition. Humana Press.
6. Bai, X., Yan, Y.. Song, Y. H., Seidensticker, M., Rabinovich, B., Metzele, R., Bankson, J., Vykoukal, D., & Alt, E.(2010). Both cultured and freshy isolated adipose tissue-derived stem cells enhance cardiac function after acute myocardial infarction. European Heart Journal, 31(4), 489-501.
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