在光纤芯片上进行选择性剪切的表达谱分析

在光纤芯片上进行选择性剪切的表达谱分析

Joanne M. Yeakley 1,2 , Jian-Bing Fan 3 *, Dennis Doucet 3 , Lin Luo 3,4 , Eliza Wickham 3 , Zhen Ye 1 , Mark S. Chee 3 , and Xiang-Dong Fu 1 *

人类基因的转录过程中广泛存在着 mRNA的选择性剪切和许多相似序列基因的表达，这类相似序列一般在标准的生物芯片技术中难以区分。在这篇文章中，我们介绍一种基于光纤技术的生物芯片平台，在这个平台上可以实现同时对所有的mRNA异构物灵敏、特异的测试。这种方法不需要预先纯化RNA或合成cDNA就可以分析转录的mRNA产物。使用某种内源性表达的病毒转录子作为模型，我们的实验显示利用这种方法可以从10－100pg总细胞RNA或直接从微量细胞中检测到mRNA异构物。对人类癌细胞株的多元分析检测出mRNA的不同剪切形式，暗示绒毛膜癌发展过程中存在一种潜在的自分泌机制。在发育和疾病的研究中，我们的方法对于大规模的分析选择性剪切非常有效。

人类基因组的研究揭示接近 60％的基因通过选择性剪切，表达多种mRNA异构物 1,2 。在很多情况下，人类基因可产生成百上千的mRNA异构物 3 。例如，fly Dscam 基因能产生约38,000种mRNA，是预测的 Drosophila 基因组中基因总数的两倍 4 。这种选择性剪切的变化与细胞生理、发育调节以及癌症相关 5,6 。然而，目前大多数mRNA异构物的功能还不清楚， 对于细胞类型特异性选择性剪切的建立机制，以及信号、发育对其调节机制都还知之甚少。剖析mRNA选择性剪切的生物学意义是对基因组研究的巨大挑战，迫切需要一种新的研究方法 7 。

目前的生物芯片技术还无法分辨和分析 mRNA异构物。剪切异构物通常是插入几个核苷酸或由高度相关的外显子替换产生，而在cDNA芯片中使用的长探针无法区分这类序列的细微差别。 寡聚核苷酸芯片（包括外显子芯片，tiling芯片以及外显子/外显子接合芯片）能检测到一部分mRNA异构物（refs 8,9; M. Ares, pres. commun.）。然而，由于存在紧密相关序列的交叉杂交而使检测效果大打折扣。此外，传统的生物芯片分析灵敏度的提高依赖于目标序列的扩增方法，这些方法偏好于3’端非编码区，因此需要大量RNA以保证mRNA异构体的丰度。

我们描述了一种常用的选择性剪切的表达谱分析方法。用这种方法分析剪切异构物，不需要预先纯化 RNA或合成cDNA，就能够分辨出mRNA异构物以及紧密相关基因的转录产物，并且只需要低于纳克级的总RNA量。我们将这种方法与高通量的生物芯片平台结合，并且将这种技术应用于人类癌细胞株系基因选择性剪切的研究中。我们的研究结果显示，细胞特异性选择性剪切指示着不同生长调控机制。

结果

一种分析选择性剪切表达谱的常用方法。 我们设计了一种基于光纤芯片平台的适合大规模分析 mRNA的方法 10-12 。在这个平台上，将某种微球体（微珠）混合物与顶端蚀刻出小孔的光纤束混合，就形成了自我装配的微珠阵列（图1A）。每个微珠带有特异的寡核苷酸序列（address序列），并且每一个微珠在微阵列上的位置都经过反复杂交或解码确定。100倍线性范围内的杂交信号由CCD相机（charge-coupled device）在光纤束的另一端记录下来，在一张芯片上由多光纤束形成矩阵，可进行大规模的平行实验。(新产品使用的是分辨率0.8um的激光共聚焦扫描系统――编者)

选择性剪切的 mRNA在剪切的接合处有特定的序列，因此可以使用一种定位序列来逐个分析 13,14 。我们将与不同外显子互补的DNA寡核苷酸片断连接到一个特定address序列上，address序列能够与微珠或其它芯片上的互补序列杂交（图1B）。为了避免单核苷酸与剪切位点杂交时可能存在的非特异性杂交，我们同时结合了前文描述的方法以增加目标特异性 15,16 。在这种方法中，我们设计了两条与外显子剪切位点两侧序列互补的寡核甘酸（图1B）。mRNA异构物形成桥结构，成队的寡核甘酸就可以被连接酶连接起来。为了实现最大灵敏度，在寡核苷酸连接后，我们设计了一个信号放大的步骤，利用通用引物PCR进行扩增。通用引物的使用和相同长度片段的扩增使得扩增过程中可能存在的偏差降至最小（见下文）。

图 1C总结了这种方法，包括RNA介导的退火，选择和连接（RNA-mediated annealing, selection, and ligation, RASL）。细胞总RNA与带有address序列的寡核苷酸、通用寡核苷酸、生物素标记的oligo-dT混合物一起退火。样品被转移至streptavidin包被的PCR管中用于poly(A) + 选择。然后芯片被转移至固相，洗去多余的寡核苷酸，否则会导致非特异性连接。T4 DNA连接酶连接并列的寡核苷酸 17 。这一步是为了增加微阵列的特异性。因为从理论上来说，只有靠近的寡核苷酸才能连接，而且只有连接产物才能被PCR扩增。其中一条PCR通用引物标记了染料或生物素，用来定量芯片上RASL-PCR产物。虽然RASL-PCR法在设计上是用来测量mRNA异构物的，但是通过选择不同个体mRNA的特异序列，也可以用于基因表达谱的测定。

RASL法检测剪切 为了验证 RASL法检测选择性剪切，我们选择了已被研究的比较清楚的E1A选择性剪切的转录子作为模型系统。E1A的前体mRNA 在三个供体与一个公共的受体剪切下形成9S，12S，13S mRNA（图2A）。从转染的COS细胞中提取RNA分析显示三种剪切供体都被使用，在共转染剪切因子ASF/SF2的情况下，剪切位点倾向于13SRNA供体（图2B）。结果与先前的报道一致 18,19 。在RASL-PCR实验中也得到相同的结果，并且只有在表达E1A的细胞中才检测出一条特异性条带（图2B）。当RASL-PCR产物杂交到芯片上，测到的每一种剪切异构物的荧光强度与RT-PCR检测到的mRNA异构物的量相一致（图2C）。RASL-PCR检测的荧光强度水平定量地显示了ASF/SF2存在的情况下，9S和12S剪切产物的减少和13S剪切产物的增加（图2D）。注意，由于存在寡核苷酸结合到目标mRNA上和RASL-PCR产物杂交到芯片上的动力学差异，我们只能比较不同样本中某个基因表达量的相对变化，而不是一个样本中不同异构物的含量。因此，我们用转染了E1A的细胞中提取的RNA作为基线（1×）用于比较。我们的数据显示，虽然在用RT-PCR和RASL-PCR芯片中ASF/SF2诱导的绝对量有所不同，但是选择性剪切物的总体变化趋势是一致的。

芯片的特异性和灵敏性 为了排除瞬时转染过程中可能存在的变化和过表达，我们选择了一种 HEK 293T细胞，这种细胞携带了一个整合的腺病毒5（Ad5）片段作为内源性E1A表达系统。RT-PCR显示这种细胞表达12S和13S mRNA 的量基本相同，而9S mRNA的量很少（图3A）。RASL-PCR只能在293T的RNA中检测到E1A转录子，而在Hela细胞的RNA中检测不到，显示了这种方法的特异性（图3A）。

图 3B中的数据图进一步的验证了微阵列的特异性。在每个样本中，E1A的共用寡核苷酸由一个错配物替代。如同以前的报道 16 ，由于3’端错配和缺失影响了连接作用，极大减少了RASL-PCR的产物，由C到T的转换除外。后者可能是由于oligo-mRNA连接物中碱基对的摇摆作用。我们注意到共用寡核苷酸的变异对13S异构物的影响最大，可能是由于退火和/或连接效率的序列前后依赖性差异造成。在45℃退火的条件下，实验显示对位于剪切位点旁10个核苷酸位置的单碱基错配对不敏感，但是在同一位点如果有2个或3个碱基错配则足以区分。如果增加退火温度，特异性会进一步增加，但是灵敏度下降（数据未列出）。通过逐步摸索退火温度，我们就能找到一个适合的温度，在这个温度下，大多数寡核苷酸与目标mRNA的杂交能有效进行，同时又保留了足够的特异性来区分序列相近的转录子。

为了测定微阵列的灵敏度，我们将 293T细胞的总RNA 梯度稀释于Hela细胞的总RNA中。在这种方法中，总样本量不变，但是E1A特异的转录子的量则逐渐减少。仅10-100pg的293T细胞总RNA稀释于1μg Hela细胞总RNA中，就能够在芯片上检测到信号（图3C）。10pg总RNA基本相当与一个细胞的RNA含量。为了测试单细胞是否能用做实验材料，我们将293T细胞梯度稀释于96微孔板中，并计数每孔中的细胞数。细胞直接裂解用于RASL-PCR。芯片分析显示即使在少于10个细胞的情况下，也能检测到E1A信号（图3D）。我们用定量PCR技术评估E1A在293T细胞中的表达，结果显示单个293T细胞表达大约100个E1A转录子，这个结果与northern blotting的实验结果相符（数据未列出）。因此，以上结果显示RASL实验的灵敏度足以检测到低于纳克级的总RNA中表达比较高的转录子的特异性信号。显然，检测表达越低的信号需要的起始材料越多。

图 3C中293T RNA 梯度稀释的实验结果显示，浓度高到一定程度，信号强度开始下降（见100ng和1μg 293总RNA中，12S和13S的信号）。这个数据提示芯片在这样的浓度条件下信号输出已达到饱和。我们将继续研究以提高芯片的灵敏度和动力学范围。

多重分析 在建立 E1A模型的实验条件后，我们检测了利用RASL多重分析选择性剪切的能力。为了实现这个目的，我们准备了与23个基因来源的97个mRNA异构物配对的寡核苷酸对（ BAX, BCL2, BCL2L1, BRCA1, CASP2, CDKN2A, CDKN2B, ESR2, FAS, FGFR2, FN1, FOLH1, FYN, ITGB1, KLK3, MUC1, PTPRC, RUNX1, TERT, TP63, TP73, VEGFA, WT1 ）。

我们首先检测了在多重条件下芯片的重复性和信号输出。当相同的 RASL-PCR样本加入array matrix上的16个独立芯片后，我们发现芯片间的信号差异非常小。统计学分析显示99.7%的数据点落在它们平均值的2倍之内（图4A）。当相同的RNA样本进行RASL-PCR实验时，96.6%的数据点落在它们平均值的2倍之内（图4B）。进一步分析显示，在这些独立的RASL-PCR间，大多数变化值来源于稀有异构物的随机PCR扩增（数据未列出）。总的来说，这些数据证明了芯片的可重复性。

为了检测多重实验对信号输出的影响，我们设计了一组实验，将由 5个基因转录的10个mRNA异构物与不同浓度的与其他序列互补的寡核苷酸碱基对混合（图4C）。结果是从这10个相关序列检测到的信号与同时存在100个其他序列时的信号基本相同，说明在这种条件下多重性对结果的影响是很小的。在其他实验中我们注意到这种方法的一个局限，也就是说当多重RASL-PCR反应中存在某种高丰度的mRNA时， 会导致PCR扩增的过早饱和。结果，低丰度的信号无法扩增到可检测到的水平。因此，我们建议根据mRNA的丰度分组，以便在可定量范围内进行检测。

最后，由于 RASL产物具有相似的长度和通用的引物结合位点，进行PCR扩增时的偏差是可以最小化的。为了证实这一点，我们使用了从20个到35个不同的PCR循环数，并用一个标准的RASL-PCR扩增产物进行实验。我们发现，PCR循环次数对mRNA异构物的量的影响很小（图4D）。因此我们在实验中通常使用35个循环以达到最高灵敏度。

表达谱检测与细胞系中选择性剪切的证实 在多重条件下用 RASL做三次重复，我们检测了5个人类癌细胞系中97个异构物的表达（图5）。从芯片实验得到的结果显示6个表达的基因存在细胞特异性或剪切形式的一致性，这6个基因被用于RT-PCR实验以验证结果。将芯片与RT-PCR的实验结果比较，可以看出虽然在信号的绝对量上有所差异，但是两者的结果基本相符，可能是因为两种方法都是半定量造成的。

在我们选择比较的基因中， p16/p14 ARF 基因（ CDKN2A ）利用不同的启动子，结合不同的剪切方式表达两种功能不相关的蛋白，这两种蛋白通过不同的信号通路对细胞周期进行调控 20 。这个位点在肿瘤细胞中经常发生突变或缺失 21 。RASL和RT-PCR方法都能一致、清晰的检测出肿瘤细胞株中两种异构物的表达丰度（图5）。然而，芯片对这五种细胞的分析无法显示出内部外显子 CASP2 和 VEGFA 的选择性剪切的差别。RT-PCR的情况与此类似。无论是 RASL或RT-PCR都没有检测出 VEGFA 的从外显子5到外显子6的剪切。至于 BCL2L1 （ Bcl-X ），两种方法都显示出不同细胞系中异构物的差异。由于 CASP2 和 BCL2L1 这两个基因，每个都表达两个在调节细胞凋亡中功能相对的蛋白 22 ，因此检测凋亡信号刺激对两者的表达是否存在剪切水平的调控是很有意义的事情。

PTPRC （ CD45 ）基因编码酪氨酸磷酸酶受体，对于 T细胞的信号传导至关重要，而且在T细胞发育过程中受到选择性剪切调控 23 。这个基因在造血细胞中大量表达，与U-937和Jurkat细胞中检测到的情况一致（图5）。然而用RASL法没有检测到这两种细胞系中不同的异构体，显示我们用于检测所有可能的不同外显子组合的寡核苷酸设计还存在缺陷（见图5说明）。这个问题也许可以通过使用与L-A，L-B，L-C，L-D异构物配对的寡核苷酸对解决，这些异构物在U937和Jurkat细胞中有显著差异。但是，即使通过这种设计也无法揭示出不同外显子是如何组合的，这表明现阶段实验设计的局限性。

最后，生物芯片和 RT-PCR都检测到 FGFR2 （fibroblast growth factor receptor 2）基因的不同转录子的显著的细胞特异性（图5）。通过RT-PCR验证的RASL法对以上这些基因的实验结果显示了RASL法在多重条件下平行分析选择性剪切的可行性。

一种可能的绒毛膜癌自分泌机制 FGFR 2基因表达异构物是一种细胞特异性的表达，我们在实验中发现可以将RASL-PCR方法用于解决癌症中的生物学问题。 FGFR2 基因产生两种异构物：B形式编码的 FGFR2 存在于成纤维细胞中，而以K形式编码的KGFR存在于上皮细胞中 24 。由于成纤维细胞分泌KGF，而上皮细胞分泌FGF，因此建立了一种旁分泌循环来调控发育 25-27 。在成纤维细胞中建立自分泌环以高表达KGF能够引起细胞癌变 24, 28 。这样的 FGFR2 剪切形式的转变被认为与前列腺癌中癌细胞的变化是一致的 29, 30 。我们因此增加了几个细胞系进行RASL分析，其中包括来源于人类前列腺癌的细胞系（图6）。虽然在3个细胞系中检测到 FGFR2 的高水平表达（表达 KGFR 的JAR和HT-29，表达 FGFR2 的293T），在两个前列腺癌细胞系LNCaP和PC3中 FGFR2 mRNA异构物的表达还是不显著。定量RT-PCR显示所有我们检测的前列腺细胞系表达 FGFR2 转录子在＜0.01拷贝/细胞的水平（数据未列出）。这种低水平的表达是否与肿瘤生长有关，还需要进一步的研究。

在 HT-29和JAR细胞中KGFR mRNA异构物的高水平表达促使我们检测其配体在这些细胞中是否表达。RT-PCR结果显示，在HT-29和JAR细胞中都表达相当量的KGF mRNA，提示在这些细胞中可能存在潜在的自分泌发育刺激机制（图6）。HT-29细胞来源于一种结肠直肠腺癌细胞。最近研究显示人类结肠癌细胞中 KGF 和 KGFR 都过量表达 31 。JAR细胞来源于一种绒毛膜癌。因为正常胎盘细胞的不同类型存在KGF/KGFR旁分泌信号 32 ，我们的结果和另一个来源于绒毛膜癌的细胞系BeWo 33 的实验结果表明，建立KGFR/KGF自分泌环可能在人类胎盘肿瘤中起到重要的作用。RASL技术可以应用在研究不同的临床肿瘤上，来验证在多种组织中自分泌环对致癌发生起作用的假说。

讨论

我们描述了一种基于微珠技术的光纤芯片平台，用于平行分析基因表达和选择性剪切。这种可定位的方法有很大的应用范围，使用通用的芯片格式。由于这项技术的高特异性，芯片可用于区分同一基因的不同 mRNA的异构物。原则上这种方法也可以用于检测基因表达，特别是区分紧密相关基因的转录子，或者等位基因的转录子。通过扩增步骤提高灵敏度特别适合于检测显微分离组织的基因表达，并且芯片的array matrix格式使得多样本平行分析成为可能。

目前该技术还有些限制。第一，由于剪切使用依赖于剪切位点序列，我们对杂交的最合适序列的选择余地不大。第二，由于 RASL-PCR方法是以已知序列作为目标，所以这种方法不适合于新的转录子的表达检测。目前，RASL技术可能最适合用于对不同数据库中已知基因的大规模分析。与显微分离相结合，这种方法可能可以进一步用于组织样品中特定细胞的异构物分析。这种方法可能尤其适用于实体瘤的分子生物学分析。最后，正如前文提到的，当某一转录子的多个区域都存在选择性剪切的时候，RASL可能不适合鉴定mRNA异构物。在这情况下，RASL技术可以用于检测剪切位点的使用频率，但是推断异构物的全长序列还是需要cDNA克隆和测序。

我们希望 RASL-PCR技术能有助于阐明发育和疾病中选择性剪切的作用和调节。我们的研究揭示了在人类肿瘤细胞系存在细胞特异性基因表达（ PTPRC ），启动子的选择利用（ CDKN2A ）， 和不同外显子的选择（ FGFR2 ）。因此，我们的方法可能可以通过对特定肿瘤型或亚型中转录子丰度和选择性剪切的特点的鉴定，实现对癌细胞从分子水平的分类。这种芯片技术的灵敏性对于解决对极少量细胞进行检测的需求具有特殊的优越性，比如研究免疫系统和神经系统中的分子多样性。

实验程序

目标序列选择和寡核苷酸设计 选择性外显子序列通过科学文献和公共基因数据库查得。基因的选择主要基于其在生长调控中的作用和相对简单的剪切模式。寡核苷酸设计为与剪切位点两侧各20个核苷酸互补。外显子特异性的序列（20-mers）与address序列（20-24 mers）相连，通过计算使分子内碱基配对减到最低程度。为信号扩增，T7和T3引物序列（23mers）也与address序列相连。生物素标记的T7引物用于扩增，以标记与芯片杂交的序列。

RASL-PCR 与上游外显子序列互补的寡核苷酸先与酶进行连接反应。在 40μL的lysis/binding缓冲液（20mM Tris-Cl，pH 7.6， 500mM NaCl， 1mM EDTA，0.1% SDS）中将总RNA（通常是1μg）或细胞裂解物与100 fmol的寡核苷酸和2 pmol biotin-（dT） 25 退火。在更少RNA样本的实验中，可以通过加入酵母菌tRNA将总RNA量调节为1μg。样本在94℃加热2 min，45℃ 5min，然后转入streptavidin 包被的PCR管中(Roche, Indianapolis, IN)。45℃ 退火和选择1h，然后用预先加热到45℃的含0.1% Triton X-100的洗液（20mM Tris-Cl，pH 7.6， 100mM NaCl， 1mM EDTA）洗三遍。再用不含Triton的洗液或连接缓冲液 (Fermentas,Hanover, MD) 洗一遍。然后在37℃，用含有10 U T4 DNA连接酶(Fermentas)的40 μL 连接缓冲液温育连接1h。用含有Triton的洗液洗一遍，再用不含Triton的洗液洗一遍。用40μL水在65℃洗脱完成连接的寡核苷酸，5min。10%-100%之间的洗脱液被用作模板，与T3、生物素标记的T7引物在50μL反应体系进行PCR反应（94℃ 变性15s，54℃退火 30s，72℃ 延伸30s；35个循环）。10-20%的PCR产物跑胶。

芯片组装，杂交和成像 芯片通过光纤束顶端蚀刻的孔和带有寡核苷酸的玻璃微珠（直径3-5μm）组装而成。在现有的芯片格式中，50,000根光纤形成直径为1.4mm的六棱形的光纤束。解码通过芯片与荧光标记的互补序列杂交实现。通过一系列杂交，每周微珠上的相应的address序列可以产生不同的颜色编码。解码的精确度可达99.9%。对每块芯片上的任意一个微珠的类型，杂交后荧光强度的差异系数在20-30%之间。在统计学考虑和计算机模拟的基础上，可靠的表达水平的定量需要每个address有5个微珠。在这篇报道中使用的芯片，每个address使用了大约100个微珠。例如，在图4A和图4B中，分别平均使用了116和104个微珠，两者的标准偏差分别为41和36。

实验中有些步骤需要在水溶液进行，这需要将芯片上的微珠端浸没在含有杂交液或洗液的孔中完成。微珠在 0.1M NaOH中放置1min，然后在杂交缓冲液（0.1 M磷酸钾，pH 7.6，1M NaCl， 0.1% Tween –20，5%乙醇）中中和。芯片在含有100 μg/ml 的青鱼精子DNA的杂交缓冲液中预杂交30 min, 48℃。用杂交缓冲液洗后，加1－8μL的RASL-PCR产物到终体积为50μL的反应体系中(含100 μg/mL 的青鱼精液DNA和0.3μM未标记的T3，T7引物)变性，与芯片杂交3h, 48℃。杂交后，48℃用5mM磷酸钠，pH 7.4，74.5mM NaCl，0.5mM EDTA，0.01% Triton X-100冲洗芯片3min， 再在48℃用10mM磷酸钠，pH 7.4，149mM NaCl，1mM EDTA，0.01% Triton X-100冲洗芯片3min，然后在杂交缓冲液中放置7min。

为了定量与芯片杂交的生物素标记的寡核苷酸，芯片在含有 2mg/ml BSA 的杂交缓冲液中封闭3min，然后用含有2μg/ml streptavidin–phycoerythrin偶联物(Molecular Probes, Eugene, OR)的同一杂交缓冲液染色15min。用杂交缓冲液中洗3-5次后，获取图像。使用540nm的激发光滤光片、580nm的发射光滤光片和1μm/像素的CCD摄像头。利用Ultralite软件（Illumina）经过2-5s将数据整合。

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