第二章 现代生化实验技术

第一节    离心技术

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。

悬浮在液体中的固相颗粒的运动速度取决于：

1．重力——液体中的颗粒处在重力场内时，如在一支平稳的试管内，将会受到地球的重力的作用而运动。

2．固液相对密度的差别——相对密度小于液相的颗粒悬浮在上面，相对密度大于液相的颗粒则沉淀下来。

3．颗粒的大小与形状。

4．沉降介质的粘滞力。

一、离心力的计算：

离心机的加速度通常以重力加速度（g=9.80m/s²）的倍数来表示，称为相对离心力（RCF或“g值”）。RCF取决于转子的转速（n，以每分钟转数计r/min）和旋转半径（r，以mm计），可用公式表示如下：

此公式变形后，在已知r和RCF的值时可以用来计算转速（r/min）：

然而，须注意到RCF值在离心管内并不是处处相等：在靠近转子外侧处的值最大（r_max）靠近中心轴处的值最小（r_min）。应用中，习惯上所说的RCF值都是指旋转的平均半径（r_av）。另外，需注意的是RCF的值是转速值的平方的函数，因此增加41%的速度就可使RCF提高两倍。

二、离心分离的方法：

1．差速沉降（沉淀）法：

将一混合悬浮液以一定的RCF离心一定的时间后，混合物将会被分为沉淀和上清液两部分。从一种悬浮液中，增加RCF，以固定的离心时间连续分离沉淀的方法被广泛应用于从细胞匀浆中分离细胞器。(a)离心前盛在离心管内的是含有大、中、小三种颗粒的悬浮液；（b）低速离心后，沉淀主要由最大的颗粒组成；（c）进一步用高速离心上清液，得到主要由中等大小颗粒组成的第二种沉淀；（d）最后一步用离心把余下的小颗粒沉淀下来。

差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

　2． 密度梯度离心法：

区带离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有  

一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：

① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。 

下列技术使用了密度梯度，即离心管中的溶液从管中的溶液从管顶到管底密度逐渐增加：

密度梯度。

（a）连续密度梯度。（b）非连续密度梯度，以递减浓度的梯度平铺叠加而形成。（c）单梯度密度屏障，设计用于选择性的沉降一种类型的颗粒

差速区带离心法：

将样品置于平缓的预先制好密度梯度介质上，进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快地沉降

离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率沿管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。从颗粒的沉降情况看来，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。

在离心过程中，区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。

等密度离心法：

当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度离心法。等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒的大小和形状无关。但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。颗粒的浮力密度不是恒定不变的，还与其原来密度、水化程度及梯度溶质的同透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。例如某些颗粒容易发生水化使密度降低。

这种技术根据浮力密度的不同分离物质。其分辨率受颗粒性质（密度、均一性、含量）、梯度性质（形状、粘度、斜率）转子类型、离心速率和时间的影响。颗粒区带宽度与梯度斜率、离心力、颗粒相对分子质量成正比。几种物质可通过离心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖、菲可、尼克登）。将样品与适当的介质混合后离心——各种颗粒在与其等密度的介质带处形成沉淀区带。这种方法要求介质梯度应有一定的陡度，要有足够的离心时间形成梯度颗粒的再分配，进一步离心对其不会有影响。

可以使用一根细的巴氏滴管或带有细长针头的注射器来收集某个密度梯度内的条带。另一种方法可将试管刺穿，将内容物分段逐滴收集到几个管中。

三、离心机的类型：

四、 转子

许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。

1．水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。

2．角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。

3．垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。

五、离心管

离心管有各种大小（1.5ml到1000ml），所用材料也不一，下面是选择离心管时应考虑的一些性能。

1)      容量。由样品的体积决定。注意在有些应用中（如高速离心）离心管必须装满。

2)      形状。收集沉淀时，用圆锥性管底的离心管较好，而进行密度梯度离心时圆底试管

更有用。

3)      最大离心力。详细信息由厂家提供。

4)      耐腐蚀性。玻璃管是惰性物质，聚碳酸酯管对有机溶剂（如乙醇、丙酮）敏感，而

聚丙烯具有更好的耐腐蚀性。详细信息可参考厂家的说明书。

5)      灭菌。一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使

用。多次高压灭菌可能会导致聚碳酸酯崩裂或变形。

6)      透明度。玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明。

7)      能否刺穿。若你想用刺穿管壁的方法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管易于用注

射管针头刺穿。

8)      管帽。大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏

出并在离心过程中支撑离心管，防止其离心时变形。对于放射性样品，即使是低速离心也一定要盖管帽，并且要使用与所用离心管配套的管帽。

六、平衡转子：

为确保离心机的安全运转，使用时必须平衡转子，否则转轴及转子组件可能会损坏；严重时转子可能会停转，造成事故。记得绝对不可以用目测来平衡离心管——而要用天平。一个35ml盛满液体的试管在3000gRCF的加速下旋转，其有效重量要大于一个大块头的成年男子。

要点：使用前平衡离心管至关重要，通常的原则是用托盘天平平衡所有样品管，差值

控制在1%以内或更少。把平衡好的试管成对放在相对的位置上。

七、安全措施：

由于离心机的高速旋转并由此产生极大的力，如使用方法不正确，可能造成及其危险的隐患。为了安全起见，所有离心机内装有一块包围着转子的钢板，以避免转子出故障时会有碎片飞出。离心机通常有一个安全锁，以确保机盖盖上时电机才转动，同时阻止在转子停止运转之前打开机盖。不要使用没有安全锁的老式离心机或锁装置坏了的离心机。尤其注意确保头发及衣服远离旋转部件。