原子吸收硫化锌法间接测定半胱氨酸络合反应的机理研究

作者:刘文涵,单胜艳,张丹,吴小琼

摘　要：通过编程计算半胱氨酸和锌离子在不同pH条件下的各种存在形式, 通过分析拟合分布图, 研究了硫化锌法原子吸收间接测定半胱氨酸时的pH 对原子吸收的影响及络合反应的机理。经对不同形态的半胱氨酸与金属锌离子的共存区域的各种离子的组合探讨, 发现在最佳测定条件下的半胱氨酸是以负一价荷电形态的半胱氨酸基Cys-与Zn(OH)2形成了可溶性络合离子[HS-CH2CH(NH2)-COO]2Zn(OH)2。结果表明,理论分析计算的结果与实验数据得到了很好的吻合。
主题词：火焰原子吸收光谱法;半胱氨酸;间接测定;ZnS;机理研究

引　言
利用新生成的硫化锌悬浮液与半胱氨酸Cysteine (简记Cys) 反应产生可溶性的络合物, 用塞曼火焰原子吸收分光光谱法测定溶液中的总锌浓度, 可间接获知半胱氨酸的含量,从而可建立硫化锌法原子吸收光谱间接测定半胱氨酸。在间接测定的条件选择中发现,在碱性条件下有一个最佳pH峰值, 表明在不同pH条件下, 溶液中的各种离子或分子, 随着pH 的变化有着不同的存在状态。在最佳测定条件下的组合络合是什么? 整个测定又是利用的哪一种物质? 研究其络合反应的机理, 对氨基酸与金属离子的络合研究亦有一定的帮助, 也有利于研究类似的原子吸收间接测定工作的开展和深入。
本文利用计算机对半胱氨酸和金属锌离子在不同pH 溶液中的离子状态及分布作数值分析和拟合作图, 研究探讨在最佳pH 测定条件下的离子组合状态, 确定了硫化锌法原子吸收间接测定半胱氨酸时的络合反应机理及络合物的组成结构。
1 　实验部分
1.1 　仪器与试剂
日立180280 型塞曼火焰原子吸收分光光度计; 日立牌锌空心阴极灯; HI 9321 Microprocessor pH meter ( HANNA instruments) 。半胱氨酸标准溶液(200μg/mL ):精确称取0.0200g /L-半胱氨酸(生化试剂) 溶于2mL 0.2mol/L的NaOH溶液, 用蒸馏水稀释至100mL 。临用时配制。2 %氯化锌溶液; 3 %硫化钠溶液; 试剂均为AR级, 水为离子交换水。
1.2 　实验步骤
硫化锌悬浮液的制备: 取2mL 2%氯化锌溶液, 边搅拌边加入4mL 3% 硫化钠溶液, 摇匀后离心分离, 倾去上层清液, 用6mL 2 % Na2B4O7 硼砂水溶液将沉淀洗涤两次, 加0.3g 固体NaCl,用2% 的Na2B4O7溶液将沉淀稀释至100
mL 。
精确移取一定量的半胱氨酸标准溶液或样品溶液于10mL 离心管中,加入1.5mL ZnS悬浮液, 用力振荡均匀, 放置25 min , 用离子交换水稀释至6.00mL 摇匀,离心分离后, 以试剂空白作参比,用塞曼火焰原子吸收测定上层清液中锌的FAAS 信号响应。
2 　结果与讨论
2.1 　半胱氨酸的间接测定原理及不同pH的影响
利用半胱氨酸根在一定条件下与新生成的硫化锌中的锌发生络合反应, 定量的形成可溶性络合物, 再将溶液中多余的硫化锌沉淀分离, 测定上层清液中的锌含量, 即可间接的测定半胱氨酸的含量。
在原子吸收光谱仪器最佳测定的条件下, 测定在同一缓冲溶液pH 条件下溶液对原子吸收响应的关系曲线。由于ZnS 在pH< 7时会发生溶解, 因而只能在碱性溶液中进行考察。随着pH 的增大吸光度响应随之增大,在pH 9.7时达到最大值。
在pH > 9.7 以后, 响应反而下降, 表明溶液中的锌离子含量, 随着pH 的增大而降低, 存在着另一种付反应的发生,降低了可溶性的锌络合物的存量。
2.2 　半胱氨酸的存在形式及在不同pH条件下的分布
半胱氨酸在水溶液中有4 种不同的电离状态, (1) Cys + , (2) Cys ± , (3) Cys - , (4) Cys2 - 分子式, 相应的荷电荷分别为+ 1 , 0 , - 1 和- 2 价。当主要为(2) 时, 半胱氨酸为电中性等电点, 此时的pH 为5102 。改变溶液的pH 值时, 半胱氨酸的带电情况会随着溶液H+ 的浓度变化而发生改变。
是根据半胱氨酸在水溶液中的各级酸碱解离常数, 通过自己编制的计算机程序计算和绘制的不同pH条件下半胱氨酸的不同形态的分布情况。
可以看出, 半胱氨酸的第1种形态Cys + 基本在pH<3以下; 第2 种形态Cys±在pH 1～9.5 之间, 分布范围最大, 最大浓度出现在pH 5.10 , 此时中性分子的比例为99.90 % , 这与等电点5.2 基本吻合; 第3 种形态Cys - 分布在pH 7～11.5 之间, 最大浓度出现在pH 9.65 , 此时该形态的比例为89.56% , (2) 为4.92 % ,而(4) 为5.52 %; 第4 种形态Cys2 - 在pH 9.60 时为5 %左右, 在pH > 13 后基本全转化为带- 2 价电荷的半胱氨酸基Cys2 - 。最佳pH9.7左右的测定条件结合可知, 此时半胱氨酸的反应形式主要是以带-1价电荷的(3)Cys -与锌进行络合形成可溶性络合物的。
2.3 　锌离子在不同pH条件下的存在形式及分布
同样金属锌离子在不同pH 条件下会有不同的存在形式, 在酸性时以Zn2 + 形式存在, 由于Zn (OH) 2 是两性化合物, 能够在强碱性溶液中溶解, 与OH- 形成络合物。其各级络合形式及累积形成常数[ 4 , 5 ] , 见下列各式。
Zn2 + + OH- = Zn(OH) + 　log K1 = 4.40 (5)
Zn2+ + 2OH- = Zn(OH) 02logβ2 = 11.30 (6)
Zn2 + + 3OH- = Zn(OH)3- ogβ3 = 14114 (7)
是根据锌离子的各级反应和累积形成常数, 通过微机编程和数值计算绘制的锌离子在不同pH 条件下的状态分布图。可以看出, pH 7.6以下的溶液中主要以Zn2+的简单形式存在, 含量比例在96 % 以上。络合式Zn (OH) + 和
Zn (OH)3-是两种中间过渡形态, 其最大含量分别在pH 8.4时的2.71 %和pH 10.8 时的18.6 %。络合形式Zn (OH) 2 的最大含量在pH 9.4为96.9% ,在pH < 9.4 时急速下降, pH8.0 时为16.3 % , pH 7.6 时为3.0 % , 在pH > 9.4 时, 并最终全部转化为Zn (OH) 2-4而溶解。
2.4 　最佳测定条件时的离子组合形式
不同形态的半胱氨酸基Cys ± , Cys - , Cys2 - 与锌离子在pH 9.7左右时的共存区域图, 图中的Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ,分别为Cys±, Cys-, Cys2-形态与Zn(OH)2共存。可以看出, 在间接测定半胱氨酸最佳pH 9.7左右时的半胱氨酸形式主要只有这3种分子形态, 而金属锌离子主要以Zn(OH)2形式存在, 结合图1 的最佳测定pH 值9.7,不难看出此时半胱氨酸是以-1价的Cys-形态与Zn(OH)2形成可溶性络合物价。
2.5 　间接测定络合反应机理探讨
测定选择在最佳pH 9.7时进行,此时硫化锌存在着平衡。
3 　结　论
通过计算机对半胱氨酸和锌离子在不同pH条件下的数值拟合和图示分布研究, 并对硫化锌法原子吸收间接测定半胱氨酸时的不同pH 对响应值的影响曲线的分析, 表明在最佳pH 9.7的测定条件下, 溶液中所测得的为带-1 价电荷的半胱氨酸基Cys-和Zn(OH)2组成的可溶性络合物。而形成pH影响峰的原因是由于半胱氨酸和Zn(OH)2 在不同pH情况下的浓度分布所形成的, 并由此推测出了可溶性络合物的结构。
参考文献
[1]LIU Wen-han , ZHANG Qing-xin , ZHANG Qing-yi , et al (刘文涵, 章庆新, 张清义, 等) . Journal of Instrumental Analysis(分析测试学报) ,2003 , 22 (4) : 58.