蛋白纯化中的一点j经验

蛋白纯化中的一点心得

1.大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

2.利用Ni2+亲和层析纯化带有His Tag的融合蛋白，在洗脱非特异结合蛋白的时候，首先用PBS洗脱3遍，每次10min，然后用含有低浓度的咪唑（40mM）的PBS继续洗涤3遍，每遍10min；这样可以将非特异的结合蛋白降低到最低。

3.本人在选择亲和层析的时候偏向于选择beads而不是已经量化的柱子。分析其原因是因为beads的用量可以根据自己要纯化的蛋白的多少决定beads的用量，而柱子不能；另外，一种蛋白最好选择单独的纯化系统，无论怎样洗脱，都很难将结合的蛋白全部洗下来，这样就很容易对接下来其他蛋白的纯化造成污染。

4.Novagen的NTA是用来纯化His tag得比较好的产品，Pharmasia的GST tag纯化系统比较好。

5.要是纯化后的蛋白用来做PULL-DOWN试验，最后的洗脱步骤就不用做了，直接将挂有蛋白的Beads保存在4度，不过要添加一定量的蛋白酶抑制剂和NaN3，保存时间可以到一个月。

6.最后做完试验，要上样SDS-PAGE鉴定，不用将蛋白洗脱下来，直接取10ul 的beads然后加入等体积的2*上样buffer，然后沸水煮沸10min，短暂离心后，去5ul就可以上样了。

（来源：来宝网）

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