间接原子吸收法测定葡萄籽提取物中的原花青素

作者:马亚军，郎惠云，董发昕

摘要：提出了间接测定葡萄籽提取物中原花青素的原子吸收光谱法。它是基于原花青索能与醋酸铜发生络合反应，生成难溶于水的棕黄色沉淀，经离心分离后，用原子吸收法测定上清液中过量的铜离子，可间接测定原花青素的含量。方法线性范围为3．0～30．0 mg／L；RSD为1．1％～1．2％ ；回收率为98．9％～102．O％。
关键词:葡萄籽,原花青索，间接原子吸收法

1 引 言
    原花青素(procyanidins)是自然界中广泛存在的聚多酚类混合物，主要由儿茶索和表儿茶素的单体、二聚体、三聚体、??十聚体等组合而成。低聚原花青素(oliomefic proyanidins简称OPS’s)以其高效、低毒、高生物利用率而著称 ，据文献报道，OPS’s拥有强有力的抗氧化能力，在体内其抗氧、清除自由基的能力是VE的5O倍，VC的2O倍。OPS’s被广泛用于食品、饮料、化妆品及保健品等诸领域，起到抗氧化、防腐、延长食品货架寿命及美容、延缓衰老之功效。关于原花青素的测定方法尚无统一标准，文献报道的有正丁醇．盐酸法、香草醛．盐酸法及铁盐催化比色法 、薄层层析法 、HPLC、HPLC/MS法等。间接原子吸收法测定葡萄籽提取物原花青素尚无报道。本实验利用原花青素分子结构中存在酚羟基，故原花青素在中性介质中能与醋酸铜络合沉淀剂反应而产生难溶的棕黄色沉淀 ，经离心分离后，通过原子吸收法测定上清液中过量的Cu2+，从而建立一种间接测定原花青素的方法。本法具有简便、快速，试剂用量少等优点，用于实际样品测定，结果满意。

2 实验部分
2．1 仪器和试剂：TAS-986原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；铜空心阴极灯(上海电光公司)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；Plus 420A酸度计(美国OrionN公司)；XYJ80-2离心沉淀机(江苏医疗仪器厂)。原花青素标准储备液(3 g／L)：准确称取0．3 g原花青素标准品(99．5％ ，云南生物资源开发公司提供)用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，用时稀释成0．3 g／L的标准使用液；醋酸铜溶液(1 g／L)：用时稀释成0．1 g／L的标准使用液。以上试剂均为分析纯，水为二次去离子水。
2. 2 实验方法：移取一定量的原花青素标准使用液于10 mL离心试管中，加1 mL 1 g／L的醋酸铜溶液，用水稀释至刻度，充分混匀，在8O℃水浴中反应25 rain，冷至室温后离心分离，小心吸取上清液2 mL于10 mL比色管中，用水稀释至刻度，以水为空白，喷人空气-乙炔火焰，测定其吸光度(λ324.7nm )。
2．3 工作曲线的绘制：依次移取0．0、0．1、0．3、0．5、0．7、0．9及1．0 mL 0．3 g／L的原花青素标准使用液于10 mL离心试管中，标准系列浓度分别为0．0、3．0、9．0、15．0、21．0、27．0及30．0 mg／L。按实验方法测定，以吸光度A对原花青素使用液的浓度绘制工作曲线。其线性回归方程为A=-0．0023 C(ms／L)4-0．4091，r=0．9991。由此工作曲线上可直接查出原花青素的含量。

3 结果与讨论
3．1 反应温度的影响：取lmL原花青素标准使用液，按实验方法在2O一100T：范围内进行实验，测定其吸光度。结果表明，在2O一85℃范围内，随着温度的升高，沉淀增多，吸光度值逐渐减小；当温度在75～85℃范围内。A值小而稳定，说明此时沉淀最多，反应比较完全；当温度超过85℃时，随着温度的升高，沉淀逐渐减少，吸光度值逐渐增大。因此，实验选择反应温度为80℃。
3．2 反应时间的影响：取l mL原花青素标准使用液，按实验方法操作，在8O℃水浴中反应不同的时间，测定其吸光度。结果表明，反应时间20 min以后，吸光度值趋于稳定。实验选用反应时间为25 min。
3．3 溶液pH值的影响：取l mL原花青素标准使用液，在不同pH值条件下，按实验方法进行实验。结果如图1所示。溶液pH在5—7范围内，A值小而稳定，说明此时沉淀最多，反应比较完全。当pH<5时，由于介质酸度过大，沉淀不易生成；当pH>7以后，溶液成碱性，铜盐水解生成氢氧化铜沉淀，使测定结果偏高。实验还考察了水和0．1 mol／mL柠檬酸钠-NaOH、硼酸．硼砂、邻苯二甲酸氢钾-NaOH及醋酸·醋酸钠4种缓冲体系，以在水为反应介质条件下的吸光度值小而稳定，这是因为后4种缓冲溶液中的有机酸部分对铜离子有络合作用，对沉淀的形成有影响。因此本实验选择水为反应介质。
3．4 试剂用量的影响：醋酸铜溶液的用量对测定结果有一定的影响。本实验选用不同量的铜试剂进行实验。结果表明：沉淀剂用量太少，沉淀不易生成；用量太多，造成标准曲线弯曲，且本实验图I 溶液pH值对反应的影响是测定上清液中Cu 的剩余量，Cu用量过多，将增加稀释步骤。综合考虑，本实验选用1 L的醋酸铜溶液l mL。
3．5 千扰物质的影响：经原花青素内含物纯品验证：在原花青素标准使用液中分别加入同倍于原花青素的淀粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉溶液，2倍的羟甲基纤维素、糊精，对测定无影响；而同倍的氨基酸对测定有干扰，但在一般情况下，原花青素中氨基酸含量比较少。
3．6 重现性实验：分别取l mL原花青素的标准使用液11份，按实验方法测定，相对标准偏差(RSD)为1．1％～1．2％ 。
3．7 样品的测定：准确称取葡萄籽提取物保健药品5粒，研细混匀，称取适量(相当于原花青素300 ms)溶解，定容于100 mL容量瓶中，于过滤后取其滤液10 mL定容于100 mL容量瓶中。取样品溶液lμL，按实验方法测定，计算样品含量，结果见表l。本方法可快速、准确地测定葡萄籽提取物中原花青素。