分子实验之如何保证样本核酸稳定？

其实问题有可能出现在样本保存与前处理步骤中哦。生物样本中的核酸(DNA/RNA)会因为核酸酶、温度、pH值、微生物、自身化学性质等因素而发生被动或主动降解，从而导致分子实验结果不尽人意。目前针对不同科研的需求，更多的样本保存方式也相继问世，小爱为大家汇总了各类样本保存的步骤、注意事项、以及样本保存耗材或保存液的推荐。

一、实验样本主要类型：

分子实验中主要的样本类型有：纯核酸类、组织类、细胞类及环境类。不同样本具有不同的保存方式以及操作注意事项。

图1 常见的实验样本类型

表1 不同类型样本核酸保存方法及稳定性

二、实验样本前处理步骤及注意事项

1、组织样本：

块状组织样本短时间内无法充分裂解，一般需要进行样本预处理。组织取材在组织离体30min内完成，取样的动作要尽量快速利索，将组织按任一方向切成黄豆粒大小。

组织DNA提取：新鲜组织样本用生理盐水清洗2次，即刻进行实验。如若不立即进行实验，可用液氮速冻，-80℃冻存。

组织RNA提取：将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理,快速转入装有1mL Trizol(abs60154)的2mL离心管中，立即进行实验。若后期再进行实验，尽量保存时将样本浸入RNA样品保存液(abs9268)后置4℃冰箱过夜（4℃过夜是必需的，这样可使RNA样品保存液完全渗入到组织中），然后转移到-20℃冰箱。或者液氮研磨组织，加入Trizol，放入-80℃保存。

图2 组织样本RNA提取流程图

2、细胞样本：

DNA提取：细胞收集沉淀后，进行液氮速冻，-80℃保存。

RNA提取：

1）贴壁细胞：吸尽培养液，每10cm²培养面积加入1mL Trizol，用加样器吹打数次，以确保细胞完全裂解，然后转移至离心管中。注：贴壁细胞Trizol的使用量应由培养皿表面积决定，而非由细胞数目决定。Trizol量不足可能导致提取的RNA中有DNA污染；
2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每5-10×10⁶动植物或酵母细胞，或每1×10⁷细菌细胞加入1mL Trizol，用加样器吹打，使其完全裂解，然后转移至离心管中。 注：添加Trizol前切勿洗涤细胞，以免RNA降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。若后期再进行RNA提取实验，细胞用液氮速冻，-80℃冻存。

3、血液样本：

采用含有抗凝剂的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝剂种类多样，抗凝剂的种类也会直接影响后续检测结果，面对这么多的采血管如何进行选择？我们建议使用EDTA或枸橼酸钠抗凝管，不建议使用肝素抗凝管（因肝素在后面的核酸提取过程中很难去除，且肝素对PCR反应有很强的抑制作用，因此不建议使用肝素抗凝管）。采集完血液，颠倒混匀备用。另外冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，因此在冰冻前加入Trizol，切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。

4、血清/血浆样本：

全血不加抗凝剂分离的上清是血清，加入抗凝剂分离的上清是血浆。取全血后，静止1-2h，置于离心机3000rpm离心15min即可获得血清或血浆。

三、样本前处理利器—RNA样品保存液(abs9268)

RNA样品保存液是一种无毒的可直接使用的样品储存液，能使细胞内的RNA与RNA酶分离，防止样本中RNA表达谱发生变化。加入样本保存液的样本中RNA在室温可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃标本可以长期保存。在RNA样品保存液中保存的标本，反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。

操作步骤：

1）计算保存液用量：根据要保存的各样本的体积，计算出所需RNA样品保存液用量；a：RNA样品保存液的用量应当是组织体积的10倍(100mg组织约用1mL RNA样品保存液)；b：离心收集2×10⁷细胞RNA样品保存液的用量是1mL；
2）分装：将RNA样品保存液按需要量分装入自备保存管中；
3）切片：快速将较大的组织切成厚度＜0.5cm的任意片状，较小的组织直接取下，立即完全浸入RNA样品保存液中；
4）保存：保存时先将样本浸入RNA样品保存液后置4℃冰箱过夜，然后转移到-20℃冰箱或继续转移至-80℃冰箱。

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