TUNEL细胞凋亡试剂盒选择指南及常见问题

检测原理：

细胞发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180bp-200bp的DNA片段。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TdT) 的催化作用下，与荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而通过光学显微镜、荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 (Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL) 。

图1 TUNEL试剂盒原理示意图

应用范围：

可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。

产品优势：

1、应用范围广：可用于贴壁细胞、悬浮细胞、冷冻切片、石蜡切片；

2、灵敏度高：可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色；

3、简单快速：仅需1.5-3h即可完成；

4、信噪比高：背景染色极低，阳性染色明亮；

5、检测方法多样：荧光显微镜、流式细胞仪、光学显微镜。

选择指南：

图2  TUNEL试剂盒选择指南

常见问题解答：

1、红色荧光和绿色荧光的试剂盒与生物素标记的试剂盒有何不同？

最大的区别在于适配的仪器不同，生物素标记的试剂盒适配光学显微镜，所以在细胞核染色时生物素标记的试剂盒一般适配苏木素或者甲基绿，荧光素标记的试剂盒一般适配DAPI ，但是荧光素标记的试剂盒实验时间、短操作简便、结果易观察。

图3 TUNEL细胞凋亡试剂盒（绿色荧光）

2、阳性对照和阴性对照的作用？

阳性组对照用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题，阴性组对照为了排除细胞自身凋亡、操作过程、或者染料等原因导致的非特异性染色，也用于调整拍摄曝光强度。一般情况下只需一个阳性对照和一个阴性对照，多个组织也可以设立多个阴性对照。

3、非特异标记（假阳性）？

1）细胞或组织的核酸酶或聚合酶活性水平较高（如平滑肌），DNA被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即并充分固定，阻止这些酶的活性，设置阴性对照有助于判断；
2）内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度；
3）固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛；
4）TdT酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。建议：注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能覆盖样品；
5）石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底；
6）有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。

4、没有染上荧光？

1）固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率；
2）细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整；
3）延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量；
4）确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。

图4 TUNEL及HE染色图

5、荧光背景高？

1）支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证；

2）TdT酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用；

3）DAB孵育时间过长，减少DAB染色时间；

4）处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；

5）有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色；

6）Biotin-X-dUTP的非特异性结合，在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次。

6、标记率低？

1）乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液；
2）固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间；
3）贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

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