Western Blot中蛋白样品的制备与试剂选择

     "良好的开始是成功的一半"，尤其对于生物学实验，如果没有高质量的实验样本，等待我们的很可能是失败的实验结果。优质特异的蛋白样品对Western Blot实验至关重要。下面将从蛋白样品制备的方法和试剂选择上给大家一些建议，同时也和大家分享一些因蛋白样品制备不当而导致Western Blot实验失败的案例。

√ 蛋白样品制备的基本原则

    目的蛋白因其物种来源和组织特异性的不同，在种类和性质上有很大差异，因此并没有一种制备方法可以适用于所有蛋白的提取。这就需要我们进行全面的分析后才能选择最合适的蛋白制备方法，在这个过程中遵循的一个基本原则是"知己知彼"。

    首先，"知己"是要了解：样品是来自什么物种？目的蛋白定位在哪种组织或细胞器？是可溶蛋白还是不可溶蛋白？是高丰度蛋白还是低丰度蛋白？在制备时需要保持蛋白的天然活性，还是需要变性蛋白？

    其次，"知彼"是要知道：哪种方法或试剂能够防止蛋白降解、聚集、沉淀、变性、修饰？哪种能够去除高丰度蛋白干扰，富集低丰度蛋白？哪种能去除核酸、多糖、脂肪等杂质？哪种能在有限的实验条件下，简便快速地获得高纯度且完整性好的蛋白？

    遵循"知己知彼"的原则对蛋白样品制备进行全面分析，就能明确蛋白样品制备的合适方法或试剂。

√ 细胞组织裂解液的选择

    裂解液是最普遍使用的蛋白提取试剂，可根据文献或经验自行配制，也可购买商业化的产品。常见的细胞裂解液有NP40、等。下表是根据目的蛋白的不同定位选择裂解液的建议。虽然裂解液的使用范围比较广泛，能够满足总蛋白的提取，但是无法做到特异蛋白的提取，特别是遇到低丰度蛋白或者活性蛋白功能分析时，通用型的裂解液存在很大的局限性。

√ 蛋白抽提试剂盒的选择

    蛋白抽提试剂盒的出现弥补了细胞裂解液的应用局限性，特别是针对难提取的样本或者亚细胞器蛋白的提取，例如：针对植物、动物组织/细胞、细菌、酵母等不同样品及细胞核、细胞膜、线粒体、叶绿体、溶酶体等不同亚细胞器的专业提取试剂盒。这类特化试剂盒能够针对目的蛋白的不同来源和不同组织定位进行裂解和提取，简化实验操作的同时还能提高蛋白提取的得率。

   如Vazyme公司的总蛋白提取试剂盒：一方面，该系列试剂盒有非变性的裂解配方，可最大程度地保留蛋白活性；另一方面，该系列产品无需经过反复冻融、超声破碎等传统物理裂解方法，并能在很短时间内得到高纯度的蛋白。

√ Western Blot中的蛋白样品危机

    在Western Blot中如果蛋白样品制备不当，可能会造成无信号、弱信号、条带大小不正确等实验问题。下表就此类实验问题给出案例分析和解决方案，供参考。

    以上是关于Western Blot实验过程中如何选择合适的蛋白制备方法和试剂的一些建议，以及由于蛋白样品制备不当造成实验失败的问题总结，希望能给大家一些帮助和启发。此外， Western Blot还有很多关键的实验环节需要注意，比如怎样选择高质量的抗体、怎样保护蛋白样品不被降解、怎样配制合适的SDS-PAGE凝胶等，都应操作小心谨慎。