淋巴细胞转化试验技术:形态学检查法

（一）材料与试剂
1．小牛血清  取新生的小牛，无菌采血，分离血清。于56℃灭活后分装小瓶，放入低温冰箱保存。
2．双抗  配成每毫升含青霉素1.00×104U，链霉素1.00×104U的混合液。存放于-20℃。
3．6%NaHCO3水溶液
4．肝素  以灭菌生理盐水配成500U/ml，115℃灭菌30min，4℃保存备用。
5．PHA  以灭菌生理盐水配成1 000µg/ml，经G-5漏斗过滤，分装小瓶，保存于-20℃备用。
6．姬姆萨染液、瑞氏染液。
7．pH6.4磷酸盐缓冲液：
KH₂PO₄     6.62g
Na₂HPO₄    2.56g
H₂O         1 000.00ml
8．营养液  采用199营养液或RPMI－1640营养液，配法如下：
        199营养液          79.00ml
        小牛血清            20.00ml
        “双抗”             1.00ml
依次加入后，再用高压灭菌的6% NaHCO3液调pH至7.2～7.3，分装小瓶，每 瓶0.2ml。
（二）操作方法
1． 于培养瓶内加0.2ml马血，对照组与试验组各做2瓶，试验组均加PHA 30µg；
2．37℃培养72h，每天轻摇1~2次；
3．取出培养瓶，摇散血块，倒入离心管，3 000r/min离心10min，去上清液；
4．用血球泥制备推片，晾干；
5．以瑞氏染液染2min~3min，加等量缓冲液，混匀继续染3min，蒸馏水冲洗后再用姬姆萨染液染2min~3min。加等量缓冲染液感作7min~8min，馏水冲洗，晾干；
6．镜检，观察，计数。
（三）结果判定  
在油镜下，观察淋巴细胞的形态变化（见表21-1），以头、体、尾三部分计算，至少计数100个或200个淋巴细胞，然后按公式计算出淋巴细胞形态转化率。
成年马的淋巴细胞转化率，根据原兽医大学20例检查，平均为35.58%。

不加PHA的对照组一般不转化或转化率只在1%左右。
表21-1  淋巴细胞转化前后形态学特点

转化淋巴细胞的形态特征：①体积增大，约大于原成熟的淋巴细胞的2~3倍；②细胞核膜清晰,核内染色质疏松呈网状结构，可见1~3个核仁,有的核呈分裂相；③胞浆丰富，有嗜碱性染色，核周围的胞浆有一些淡染的透明带，细胞呈伪足状突起。
（四）注意事项
1．培养液最适pH为7.2~7.4，过酸过碱都会影响细胞的生长而降低转化率。培养液的类型与动物的白细胞有关，如小鼠的淋转试验，用RPMI-1640最好，用199液则不成功。
2．培养时间  以72h~120h转化率最高，超过这个时间，则转化率反而下降。
3．吞噬细胞有时在形态上易与“过渡型”混淆。但巨噬细胞有其固有的特点，核占细胞比较小且偏一边，核染色质浓集，细胞浆呈蓝灰色或红褐色，胞浆内有大小不等的颗粒或吞噬物，且含有大小不等的气泡。
4．涂片要少蘸些细胞，推出尾部来，因淋巴细胞较大，易集中在尾部及边缘。
5．观察淋巴细胞转化，染色不要太浓，以便观察核仁。
6．严格的无菌操作，是淋巴细胞转化试验成功的关键。