DNA抽提指南(TRIZOL)

按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后，匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后，DNA溶解在8mMNaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northernanalysis的结果进行标准化，因为基因组DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同，所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤（例如苯酚抽提等等）。]

　　实验所需但试剂未提供的物品：

　　*酒精

　　*0.1M柠檬酸钠（用10%酒精配制）

　　*75%酒精

　　8mMNaOH

　　如无例外，以下操作均应在15—30℃下完成。

　　1.DNA的沉淀

　　移除中间层上残余的水样层，用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。按最初匀浆化时每1mlTRIZOL加0.3ml的无水乙醇，反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15—30℃下2—3分钟，再在2—8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA。

　　小心移除水样层对抽提的DNA的质量至关重要。

　　2.DNA的洗脱

　　移除离心后苯酚层中的上清液，如有必要，可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1M柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀两次。按最初匀浆化时每1mlTRIZOL加1ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA沉淀在15—30℃下作用30分钟（期间周期性混匀）再在2—8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后，用75%的酒精重悬DNA沉淀（每1mlTRIZOL加1.5—2ml75%酒精），在15—30℃下放置10—20分钟（期间周期性混匀）然后再在2—8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。

　　对于较大的DNA沉淀（>200μg）或样品中含有较多的非DNA物质需要用0.1M柠檬酸钠（用10%酒精配制）溶液再洗涤一次

　　3.DNA的再溶解

　　在开口的试管中空气干燥DNA5—10分钟。（不要用离心干燥；它会使得DNA极难溶解。）用8mM的NaOH溶解DNA，大致的比例为0.2—0.3μgDNA/μl。一般来说，每107个细胞或每50—70mg组织要加300—600μl的8mM的NaOH。用弱碱再溶解DNA是高度值得推荐的，因为抽提的DNA在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8mM的NaOH的pH值只有~9，一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中，DNA样品（尤其是来自组织的样品）可能含有一些不溶解的胶样物质（细胞膜碎片等）。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA得上清液转移到一新的试管中。溶于8mMNaOH中的DNA可以在4℃下放置过夜；如果是长期保存，样品中还应该用HEPES将pH值调到7—8（见表）并加入1Mm的EDTA。H值调整好后，dna可以保存于4℃或–20℃。

　　DNA的定量及预期的产量

　　取一小份溶于8mMNaOH中的DNA样品，以适当比例和水混合并测量混合液A260值，以双链DNA的A260值计算DNA含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA/ml。若以细胞数分析其相应的DNA产量，大致遵循以下比例：每1×106个分别来源于人，大鼠，小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg，6.5μg，和5.8μgDNA。

　　应用：

　　通过PCR扩增DNA：

　　在DNA再溶于8mMNaOH后，用0.1M的HEPES（见表）将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。

　　限制性核酸内切酶酶切反应：

　　用HEPES（见表）将DNA溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案，也可以用pH值为7—8的1mMEDTA透析DNA样品。每ug的DNA加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行，反应时间为3—24小时。在标准的测定中，80—90%的DNA是可被消化的。

 

　　溶于8mMNaOH中DNA样品pH值的调整：

　　（每1ml的8mMNaOH使用以下数量的0.1M或1MHEPES，游离酸。）

　　DNA抽提注意事项：

　　1.苯酚层和中间层可以在2—8℃下放置过夜。

　　2.溶于75%酒精中的DNA可以在2—8℃下放置数月。

　　3.溶于8mMNaOH中的DNA可以在2—8℃下放置过夜，若要长期保存，将其pH值调整到7—8，并调整EDTA的浓度到1mM。

　　疑难解答：

　　DNA抽提

　　•每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA产量

　　1.肝和肾，3—4μg

　　2.骨骼肌，脑组织，和胎盘，2—3μg

　　3.培养的人，大鼠，小鼠细胞(1×106)，5—7μg

　　4.纤维母细胞，5—7μg

　　•产量低

　　1.样品匀浆化或裂解不完全。

　　2.终DNA不完全再溶解。

　　•A260/280比值<1.70

　　1.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA样品。

　　2.DNA样品中的苯酚没有完全去除。用0.1M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）再洗涤DNA沉淀一次。

　　•DNA降解

　　1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。

　　2.用于抽提的样品，或已经抽提的RNA样品存放于-5—-20℃，而没有存放于-60—-70℃。

　　3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。

　　•RNA污染

　　1.水样层没有完全去除。

　　2.用0.1M的柠檬酸钠（用10%酒精配制）洗涤DNA沉淀不完全。

　　•其他的应用方面

　　在行PCR扩增前调整pH值到8.4。

　　对用于限制性核酸内切酶消化的DNA,调整其pH值到所需的范围，每μg的DNA加3—5单位的酶，对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3—24小时内。一般而言，80—90%的DNA均可以被消化。