兔抗小麦钙调素抗血清制备及纯化

 黄　 晨, 　 侯春燕, 　 王冬梅 (河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071001)

摘要: 为制备兔抗小麦钙调素抗血清并对其进行纯化 ,首先从小麦叶片中提取钙调素蛋白 ,对其初步纯化后免

疫家兔 , 制备得到兔抗小麦钙调素抗血清 ,再以大肠杆菌中诱导表达的拟南芥钙调素蛋白作为抗原 ,利用 PVDF

膜结合法纯化得到了兔抗小麦钙调素抗血清 ,并通过 Western Blot ting对所纯化的多克隆抗体进行了鉴定。

关 　 键 　 词: 钙调素; 多克隆抗体; 纯化; Western Blot ting

中图分类号: Q 942. 6 文献标识码: A

Preparation and purif ication of rabbit

anti2wheat calmodul in antiserum

HUANG Chen , HOU Chun2Yan , WANG Dong2mei

(College of Life Science ,Agricultural University of Hebei ,Baoding 071001 , China)

Abstract : To prepare and purify rabbit anti2wheat calmodulin antiserums , calmodulin protein was

ext racted f rom wheat leaves for immuned rabbit s af ter preliminary purification. Then A rabidopsis

thal iana calmodulin protein was used by E. col i induced expression as antigen to purify rabbit anti2

wheat calmodulin antiserum by PVDF membrane binding. The purified polyclonal antibody was i2

dentified by the Western Blot ting.

Key words : calmodulin ; polyclonal antibody ; purification ; Western Blot ting

　　 钙调素(Calmodulin ,CaM)作为 Ca

2 +

的多功能受

体蛋白在钙信号系统中发挥着重要作用,因此 Ca

2 +

/

CaM是目前植物细胞信号系统中研究得最为深入和

广泛的途径之一。毛爱军等的工作初步表明,Ca

2 +

/

CaM参与了小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的过敏性反应

(Hypersensitive reaction ,HR)

[1 ]

,为了进一步深入探讨

CaM在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的 HR中的作用,制

备小麦 CaM 特异性抗体是必须的,它是 CaM 定位、

定量及生理功能研究中最有效、 最特异的试剂。由于

CaM分子量小(17 kD) ,在进化上高度保守,使其免疫

源性较弱,难于制备高效价抗体。本研究以初步纯化

的小麦 CaM 蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,并对

抗血清进行了纯化,以期为深入探讨不同亚型 CaM

的亚细胞定位准备实验基础。

1 　 材料与方法

1. 1 　 材料

1. 1. 1 　 供试小麦品种　 以小麦( Tri t icum aest iv um

① 收稿日期: 2008 - 04 - 22

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(No. 30671244) ; 植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题资助项目

(No. PPB04006) ; 河北省自然科学基金资助项目(No. 303180 ; No. C2005000220 ; No. C2007000515)

作者简介: 黄 　 晨(1983 - ) ,男 ,河北邢台人 ,硕士 ,主要从事生理生化研究工作.

通讯作者: 王冬梅(1963 - ) ,女 ,河北景县人 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事逆境分子细胞生物学等研究工作.

Tel :0312 - 7528247 ,E - mail :dongmeiwang63 @hotmail . com

第 31 卷第 6 期

2 0 0 8年1 1月

河 北 农 业 大 学 学 报

JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEI

　 　 Vol . 31 No. 6

Nov . 2 0 0 8L. )品种洛夫林 10 为试材。小麦幼苗用直径 15 cm

的花盆土培 ,生长于人工气候培养室 ,昼/夜温度为

25/ 20 ℃,镝灯照射 ,光照强度为 400 W/ m2

,光照周

期 14 h/ d。小麦幼苗 7 日龄时取叶片提取 CaM。

1. 1. 2 　 供试动物　 家兔 2 只 ,购自保定兔场。

1. 1. 3 　 供试菌种　 含pET28 - CaM(拟南芥 CaM)重

组表达质粒的BL21 (DE3 )工程菌 ,由河北师范大学

细胞生物学实验室馈赠。

1. 2 　 试验方法

1. 2. 1 　 小麦 CaM 的制备 　参照文献[ 2 ]的方法提

取小麦 CaM ,并通过加热、 盐析、 等电点沉淀和透析

对其进行初步纯化后作为免疫家兔的抗原。另外利

用三氯乙酸 - 丙酮沉淀法制备小麦全蛋白 ,作为小

麦 CaM 提取方法的对照。

1. 2. 2 　 兔抗小麦 CaM 抗血清的制备　 采用背部皮

下多点注射法。免疫前采血作为对照血清 ,初次免

疫将初步纯化的小麦 CaM 5 mL 与弗氏佐剂 5 mL

混合成乳化液 ,分 5 点分别注射到 2 只家兔背部。

初次免疫 10 d 后进行加强免疫 ,随后 20 d 免疫

1 次 ,之后每周免疫 1 次。初次免疫选用完全弗氏

佐剂(Sigma 产品) ,此后均用不完全弗氏佐剂与抗

原混合。每周注射时先于耳缘静脉取血 2 mL 做酶

联免疫分析( EL ISA) ,检测抗体效价 ,至抗体效价达

到要求 ,颈动脉取全血 ,收集血清 ,分装后在 - 70 ℃

冷冻保存。

1. 2. 3 　 抗血清中抗体效价的检测 　综合文献[ 3 -

4 ]的方法 ,通过 EL ISA 法测定抗血清中抗体的效

价。以大肠杆菌中诱导表达的拟南芥 CaM 蛋白作

为抗原 ,分别用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)稀释至

30μg/ mL ,每孔加入 100μL ,4 ℃隔夜包被酶标板 ,

再用含 015 mL/ L Tween - 20 的 PBS(即 PBST)冲

洗酶标板 3 遍 ,每孔加入含 10 g/ L BSA (生工生物

工程上海有限公司产品)的 PBST 100μL ,37 ℃ 封闭

2 h ,然后用 PBST冲洗 3 遍 ,加入用封闭液稀释(先

稀释 1 000 倍后再倍比稀释)的对照血清(免疫前)

和兔抗小麦 CaM 血清(免疫后) ,37 ℃反应 2 h ,用

PBST冲洗 5 遍 ,加入相应辣根过氧化物酶标记的

羊抗兔 IgG抗体( Goat anti - Rb IgG/ HRP ,BIOS产

品;1∶ 1 000 稀释 ,100μL/孔) ,37 ℃ 反应1 h ,最后用

PBST冲洗 6 遍 ,加入含过氧化氢的底物 OPD 溶

液 ,室温避光显色 30 min ,2 mol/ L H2SO4 终止反应

(50μL/孔) 。用酶联免疫检测仪检测A490值。

1. 2. 4 　拟南芥 CaM 蛋白的诱导表达 　参照文献

[5 ]的方法并稍做改进。将带有拟南芥 CaM 重组子

的大肠杆菌接种到 LB 液体培养基上 ,在摇床中

37 ℃ 培养过夜。取过夜培养基接种于 LB 培养基液

体扩繁 ,在摇床中 37 ℃培养直到细菌密度达到

OD600 = 015 ,向培养基中加入 IPTG诱导表达 CaM ,

37 ℃ 继续培养 4 h。然后以 5 000 ×g 离心 10 min ,

4 ℃收集菌体 ,再将沉淀重悬于裂解缓冲液 ( 2 %

SDS ,5 % β- ME , 50 mmol/ L Tris - HCl ,pH 8. 0)

中 ,煮沸5 min使细胞完全裂解。以20 000 ×g离心

30 min 以纯化裂解液 ,收集上清液 ,最后经 SDS -

PAGE电泳检测。

1. 2. 5 　PVDF 膜结合法纯化 CaM 抗血清 　根据文

献[6 ]的方法 ,运用 PVDF 膜(MILL IPORE)纯化抗

体。首先将 PVDF 膜先在甲醇中浸泡 5 min ,快摇

慢加蒸馏水 ,使甲醇稀释至 20 %。再在稀释的裂解

液中渗泡 15 min ,然后转入在拟南芥中诱导表达的

CaM 蛋白 ,使其与膜共孵育 1 h。然后用含 1 %

Tween - 20 的 TBST 洗膜 4 次 ,每次 10 min ,再在

TBS中洗膜1 次 ,于温室下用含有3 %BSA 的 TBST

封闭3 h 后 ,将膜放到含有3 %BSA 的 TBST稀释的

抗血清中于室温下浸泡 3 h。之后用 TBST 洗膜

4 次 ,每次 10 min ,再在 TBS 中洗膜1 次。 然后于室

温下将膜浸在 10 mL 011 mol/ L 甘氨酸缓冲液中

(pH 215)作用10 min ,以使抗CaM 特异抗体从膜上

洗脱下来 ,并以 1 mL 1 mol/ L Tris - HCl (pH 810)

与之中和。以上操作均在脱色摇床上进行。将得到

的纯化的抗血清分装 ,储存在 - 70 ℃ 备用。

1. 2. 6 　Western Blot ting 分析 　将小麦叶片提取的

可溶性全蛋白和初步纯化的小麦 CaM 经 SDS -

PAGE后,转移至 PVDF 膜上。TBS 洗膜 1 次,用含

有5 %BSA的 TBS在室温封闭 1 h , TBST洗膜1次。

然后放入用含有 1 %BSA 的 TBS稀释的 PVDF膜结

合法纯化获得的抗血清,4℃过夜。用 TBST 在室温

下洗膜3次。再加入1∶ 10的辣根过氧化物酶标记的

羊抗兔 IgG抗体于37℃ 温育1 h ,TBST 洗膜3 次,将

膜用滤纸条吸干多余的 TBST ,正面朝上放在封口膜

上,将检测液(MILLIPORE产品)均匀加在膜上,室温

孵育3 min。暗室 X胶片压片曝光3 min后显影定影

检测。并且以1∶ 50 000 含有 1 %BSA的 TBS稀释的

抗血清作为一抗,进行同步对照试验。

65 　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 31 卷2 　 结果与分析

2. 1 　 小麦叶片 CaM制品检测

从小麦叶片中获得的初步纯化的 CaM(图 1)与

大肠杆菌表达的马铃薯 CaM 和大肠杆菌表达的拟

南芥 CaM 粗提液相比 ,与本试验所用的小麦叶片全

蛋白相比 ,蛋白条带减少了很多 ,说明经加热、 盐析、

等电点沉淀、 透析等方法已经去除了大部分杂蛋白

质 ,并且保留了 CaM 蛋白 ,达到了初步纯化的目的。

M:低分子量蛋白 marker ; 1 :大肠杆菌表达的马铃薯 CaM; 2 :初步

纯化的小麦 CaM; 3 :小麦叶片全蛋白; 4 :大肠力表达的拟南芥 CaM

粗提液

图 1 　SDS - PAGE电泳考马斯亮蓝染色

Fig. 1 　SDS - PAGE staining with coomassie brill iant blue

2. 2 　 抗体产生及效价测定

用初步纯化的小麦 CaM 提取液作为抗原免疫

家兔获得抗 CaM 抗血清 , EL ISA 法测定抗血清效

价。免疫前的对照血清对抗原基本没有反应 ,而加

强免疫后的抗血清效价不断提高 ,末次免疫后的抗

血清对抗原的反应滴度都在 1∶ 256 000 以上(见图

2) 。

图 2 　ELIS检测抗血清的效价

Fig. 2 　ELISA detection of antiserum titer

2. 3 　 多克隆抗体的特异性检测

对经 PVDF 膜结合法纯化的抗小麦 CaM 多克

隆抗体进行 Western Blot ting分析 ,以纯化前的抗血

清作为对照。结果表明:纯化后的 CaM 多克隆抗体

与本试验初步纯化的小麦 CaM 抗原能够特异结合

(图 3)重要的是在小麦全蛋白中也能检测出特异条

带 ,条带位置与大肠杆菌表达的马铃薯 CaM 检测的

条带一致 ,并且与纯化前的抗血清检测的初步纯化

的小麦 CaM 相比条带更清晰特异性更强。说明所

制备的抗体是针对小麦 CaM 的特异性抗体。

M:低分子量蛋白 marker 转 PVDF 膜后的考马斯亮蓝染色结果;A :

以纯化前的抗血清为一抗孵育的结果;A - 1 初步纯化的小麦 CaM;

A - 2 大肠杆菌表达的马铃薯 CaM;B :以 PVDF 膜结合法纯化后的

抗血清为一抗孵育的结果;B - 1 小麦叶片全蛋白;B - 2 初步纯化的

小麦 CaM

图 3 　Western Blotting检测结果

Fig. 3 　Western Blotting test results

3 　 结论与讨论

CaM是一种能与 Ca

2 +

结合的蛋白质 ,Ca

2 +

被

称为细胞内的第二信使 ,其浓度变化可调节细胞的

功能 ,无论是在动物还是在植物中 ,CaM 基因都是

以家族的形式存在的。SenGupta 等人[7 ]

的研究表

明 ,在多种动物中都存在 CaM 的基因家族。

Takezawa等[8 ]

、 Lee等[9 ]

、 Yang等[10 ]

的研究证明了

在植物中 CaM 基因也是以家族的形式存在 ,而且这

些基因编码不同亚型的 CaM。植物在进化过程中

保留了不同亚型的 CaM ,这意味着在植物体的生长

发育过程中不同亚型的 CaM 可能起着不同的作用。

Lee等人[9 ]

利用 Northern Blot ting 的方法对大豆

CaM 的 mRNA 分布进行了研究 ,结果表明发育过

程中不同器官中的 CaM 亚型基因的表达有差异。

Heo 等人[11 ]

研究发现大豆 CaM 亚型 ScaM - 4 和

ScaM - 5 在病原物激发子刺激后的核酸水平和蛋白

水平表达上都有明显升高。并且 Lee 等人[12 ]

发现

ScaM - 4、 ScaM - 5 与已发现的大部分植物 CaM 亚

型对不同的靶酶的催化激活作用有显著的差异。因

此 ,植物体中不同亚型的 CaM 尤其是氨基酸序列差

异较大的亚型在生物学功能上可能有所不同。因为

CaM 分子量小 ,保守性强 ,免疫源性较弱 ,所以 CaM

抗体的制备比较困难。本试验中 ,以初步提纯的小

75 　 第 6 期 　　　 黄 　 晨等:兔抗小麦钙调素抗血清的制备及其纯化

麦 CaM 为抗原免疫兔子 ,获得了抗血清。然后再以

大肠杆菌表达的拟南芥CaM 为抗原 ,通过 PVDF膜

结合法来纯化制备的抗血清。最后获得了能够与小

麦 CaM 呈特异结合的多克隆抗体 ,且收率较高。试

验结果显示出以 PVDF 膜结合法纯化抗血清的方

法有诸多优点:首先方法流程简单 ,所涉及的仪器设

备少;再者就是此方法对一般实验人员来说容易掌

握。在许多蛋白质的纯化过程中 ,一般所需的仪器

设备都比较复杂且价格昂贵。本试验中通过 PVDF

膜结合法来纯化制备的抗血清 ,整个流程都比较简

便 ,对蛋白粗提液只进行了初步纯化即可作为抗原

免疫动物 ,在利用 PVDF 膜结合法对抗血清进行纯

化时 ,仅需脱色摇床这一种普通的实验仪器。最终

从混合蛋白样品制备的抗血清中分离得到了特异性

较好的多克隆抗体 ,说明整个纯化过程很好地保持

了抗体的免疫功能。所得抗体可用于小麦的 CaM

定量、 定位及生理功能的研究。

为了对 CaM 功能做进一步的研究 ,制备 CaM

特异性抗体是必须的 ,它是 CaM 定位、 定量及生理

功能研究中最有效、 最特异的试剂。已有报道 ,小麦

具有 3 种亚型的 CaM 蛋白 ( TaCaM - Ⅰ, Ⅱ,

Ⅲ)

[10 ]

,但是这 3 种亚型在信号转导中的作用是否

存在差异还不明确。构建小麦 CaM 不同亚型的重

组子 ,并分别以工程菌表达不同亚型 CaM 蛋白为抗

原 ,分离纯化小麦 CaM 不同亚型的特异性多克隆抗

体是进一步深入研究小麦 CaM 在小麦抗叶锈菌侵

染诱发的防卫反应过程中具体功能所必须的。因

此 ,本试验所建立的以 PVDF 膜结合法来纯化制备

的抗血清从而获得特异性的多克隆抗体的方法 ,为

深入探讨不同亚型 CaM 的亚细胞定位及其生物学

功能奠定了重要试验基础。

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