百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答

电泳条带成笑脸状

胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高

减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳

电泳条带成皱眉状

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全

调整装置

拖尾

样品溶解不好

样品充分溶解混匀后上样

纹理(纵向条纹)

样品中含有不溶性颗粒

样品充分搅拌混匀

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜

调整电极和加样

条带两边扩散

加样量过多

适当减少上样量

Marker 变黑色

抗体和 Marker 蛋白反应

在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样

背景高

膜封闭不够

延长封闭时间，选择适宜的抗体稀释度

一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度

一抗孵育的温度偏高

建议 4℃ 结合过夜

二抗浓度度过高

降低二抗浓度

二抗的非特异性背景

增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）

二抗孵育时间过久

减少二抗孵育时间

选择膜的问题

硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低

膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润

检测时曝光时间过长

注意曝光时间的缩短

洗膜不充分

增加洗膜的时间和次数

抗体和封闭蛋白有交叉反应

检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应

杂带较多

目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小

目的蛋白有其他剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性

样品处理过程中目的蛋白发生降解

裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行

上样量过高，太敏感

适当减少上样量

一抗不纯

纯化抗体

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体

二抗的非特异性结合

增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）

一抗或二抗浓度偏高

降低抗体浓度

细胞传代较多，导致蛋白变异

使用原代或传代少的细胞作对照

蛋白条带位置

（大小）不对

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度

翻译后剪切

比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式

相对电荷

氨基酸电荷的组成

蛋白修饰

比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

胶浓度

不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差

无蛋白条带

抗体孵育不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间

酶失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因

试剂之间不匹配

一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

一抗失效

选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液

HRP 抑制剂

所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白

二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源种属的抗体

蛋白条带信号弱

抗体孵育不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间

酶活性降低

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20

标本中靶蛋白含量太低

增加样本上样量

抗体活性降低

选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置

蛋白转移不充分

可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型

曝光时间过短

延长曝光时间

HRP 抑制剂

所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

背景有黑色斑点

抗体与封闭试剂反应

使用前过滤封闭试剂

HRP 偶联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂，去除聚集体

暗背景上白色带

HRP 含量过高

降低酶联二抗的浓度

背景有不均匀的白色斑点

转膜过程中有气泡存在

仔细检测，避免存在气泡

抗体分布不均匀

孵育抗体时使用摇床