蛋白质 鉴定技术
- 来宝网2007年7月27日 10:51 点击：3365
目前，在蛋白质研究中，传统的工具仍然是研究中的主要力量，像Western blot、ELISA、IHC；但是新设备和新方法也不断涌现，都是为了用更小的样本，更快的获得重现性好的数据。本文将对Cell Biosciences、Roche、Eksigent Technologies、Invitrogen、Bio-Rad、Agilent、Beckman Coulte各公司的蛋白质检测技术及设备作一简单介绍。
文/Lori Valigra 美国剑桥市自由作家 译/贾芸
2005年6月，美国德克萨斯州一头奶牛经鉴定患疯牛病（学名为牛海绵样脑病，BSE），使得“蛋白质实验”荣幸的成为美国家喻户晓的名词。
最终鉴定结果的得出，既不是采用生物传感器，也不是其他的先进技术，而是古老的蛋白质转移吸印技术——Western blot，此前，美国农业部（USDA）采用酶联免疫吸附测定（ELISAs） 和免疫组织化学（IHC） 实验得出的结论是“不确定的和阴性结果”。之后，USDA和BSE世界标准实验室兽医实验所（VLA）进行了其他的额外实验，结果仍为阳性。德州奶牛事件使得美国农业部改变了自己的BSE实验计划。美国农业部动植物卫生检验局（APHIS）发言人Jim Rogers称，现在，在IHC和Western blot之后，都将进行ELISA试验，而不只是进行IHC试验。如果一系列实验之后确定试验是阳性结果，就可以认定样本为BSE阳性。
BSE事件再次证明了常规试验的重要性，同时也证明，天然蛋白质要比核酸复杂得多，因此蛋白质研究需要更多的工具。人类基因组测序的激烈竞赛，诞生了许多先进的基因组学工具。但是蛋白组学缺乏一种扩增技术，像用于DNA扩增的PCR技术类似的技术，因为蛋白质芯片与靶蛋白结合的条件很广泛，所以开发蛋白质芯片很难。这些原因使得ELISA、IHC、Western blot、一维（1D）和二维（2D）凝胶电泳以及质谱技术（MS）一直占据蛋白质检测市场，并且作为诊断、药物发现和开发的鉴定技术。目前，利用毛细管，这些技术得到了改进，加快了测试的速度，也有一些其他的附属技术例如液相色谱（LC） 与MS相结合使用，极大的便利了蛋白质检测。Cell Biosciences 公司CEO Linda Cahill说：“因为蛋白质很重要，所以人们才会不断的开发新技术。”
简化的Western blot
Western blot是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
自1979年Western blot问世以来，该技术几乎没有进行过改进，许多做过Western blot试验、已经毕业的研究生一想起那烦人的实验过程，都还会抱怨。实验过程是多么的复杂，像“如何从聚丙烯酰胺凝胶电泳中转移蛋白到一张硝酸纤维膜上，以获得一个可靠的原始凝胶图像的复制物。固化蛋白质不是在凝胶内部进行检测，而是通过抗体和许多分析过程进行检测。”但是，它确实是一项突破性技术，并且是一种重要的确定性分析方法。
Cahill曾对试验的普及性进行过一次调查，她对生命科学杂志进行了为期4个月的研究，对每一次的Western blot分析做了记录，在发表的文章中，与Western blot有关的文章高达85％。
虽然不断有新的蛋白质技术涌现，但Westerns blot的主导地位仍然无法撼动，因为它能对蛋白质进行分离，根据抗体可以得到更多的专一性结果。其实Western blot可以追溯到17世纪。Cahill说：“实验中需要多达100~200支不同的移液管，1~2天的手工操作过程，每一步都可能会犯错误，但是用它能进行分析实验。”
2005年夏天，Cell Biosciences公司开发了新系统——Blotless Nano Western 技术，只需要很少量的样本，就可以自动快速的得出检测结果，并且重现性好。Cahill称：“Western blot需要花费2天时间，而Blotless Nano Western只需要30分钟。”
该技术以毛细管免疫测定法为基础，可自动完成免疫印迹法的基本步骤，采用纳升容积，在毛细管里分离蛋白质。系统最初的进样量是500~1,000个细胞的一份样本，仪器能够同时进行多重毛细管操作。“我们要做的事情是确定蛋白质是否存在于样本中，它是否是一个好的药靶，如果不是，那么细胞中的蛋白质是怎么相互影响的呢？我们想弄清楚这些事情。”公司计划2006年初推出该产品。
更快、更灵敏的新技术
与Cell Biosystems公司的新产品相比，Western blotting分析需要50万个细胞，以及用于磷蛋白分化的高度特异性抗体。此外，需要2天时间才能完成一次实验，实验次数很有限。而Blotless Nano Western分析只需要不到4,000个细胞，将来可进行单细胞灵敏性分析。用一个抗体，一次试验就可以分离并检测磷和非磷物质。
Cahill称，用毛细管电泳进行试验，分离结果会更好，因为设备更容易控制。通过等电聚焦进行预分选，不只是根据蛋白质的大小进行分离，还根据蛋白质的电荷，因此，重现性好，周一早上进行的试验与周二下午进行的试验是一样的，这对生物学来说，很重要。Western blot技术能更多的用于确定BSE事件，市场潜力很大。
罗氏应用科学公司已经对Western blot技术作了一些改进，增加了一些方法和设备。公司的LumiLight和LumiLight Plus产品已经改善了化学发光信号的敏感性和持续性。罗氏产品经理Jeffrey Emch说：“我们很关注Western blot检测到的特殊蛋白质，但是用户对蛋白质进行检测和分离都很费劲。无论是学术界、医药界还是生物技术领域，这是主要的瓶颈之一。”
罗氏开发了快速翻译系统（Rapid Translation System）技术用于蛋白质的体外表达。它利用大肠杆菌或者是一种小麦胚芽溶菌液用于蛋白质生产。Emch 说：“当你在体外试验（试管内）中制造一种特定蛋白质时，你可以获得大量的此类蛋白质，但是从细胞体系中分离该蛋白质时，除了目标蛋白质，会有另外的蛋白质混杂其中，需要将目标蛋白质和其他蛋白质分离开，实际上就是减少杂质过程。”
改善凝胶
与Western blots一样，凝胶也让学生们为之烦恼：倒胶、染色、定量分析以确定蛋白质这一过程很费时间。Bio-Rad公司正在对多种产品进行改良，包括Western blots、1D 和2D凝胶。1D凝胶通过蛋白质的大小进行检测，并且通常与Western blots一起使用，2D凝胶则通过大小和电荷两方面检测蛋白质，一次实验可以观察上千种蛋白质。
Bio-Rad蛋白质分离部门经理Gustavo Salem说：“当前，2D凝胶仍然代表了最高的分辨技术，一次分析可对最大量的蛋白质进行分析。其他任何特异性技术无法取代2D凝胶，但可以继续对2D凝胶进行改善, 尤其是当它与样品制备有关时，可以为特殊蛋白质提供更好的分辨率。例如，在研究低丰度蛋白时，凝胶的清洁程度和重现性对样品制备步骤很关键。
哈佛大学化学生物学助理教授Gavin MacBeath认为，样本中有上千种不同的蛋白质，LC 和毛细管多维柱色谱（MDCC）与MS搭配使用，将为研究人员提供更多的方便。用MDCC与MS，“只需要很小的样本量，就可以深入研究蛋白质组的内容”。
Eksigent Technologies LLC 公司总裁Jeffrey Jensen希望人们不再使用2D凝胶技术，而是用色谱技术替换。该公司拥有多维LC分离产品，与质谱仪器一起使用时，能检测低丰度蛋白。为了获得低浓度蛋白，需要一个很低的流速，Eksigent称可以采用微流体控制（MFC）技术。MFC用计量器持续的检测每个流动相的流速，流动相有一个微处理器对压强做出反应，因此不需要气流分流就可获得低至20 nL/min的纳级别流速。样品无泄漏处理率高达99％以上，气流分流能控制流速，这样进入质谱仪的量就很少。
其他辅助技术
另外的趋势就是将不同的分离技术相组合，以分离特殊种类的蛋白质。例如，在一个离子交换树脂柱中，LC系统和凝胶结合使用具有纯化能力，然后，根据大小在凝胶上进行分离，最后进行质谱分析。近来，等电聚焦分离的需求越来越多，Bio-Rad公司的Rotofor系统可以与凝胶和LC一起使用。
此外，Invitrogen公司最近也开发了SILAC试剂用于蛋白质的鉴定和定量。通过1D 凝胶，SILAC可以纯合蛋白质，然后进入质谱仪分析。SILAC是一种新陈代谢标志性方法，能对处于正常和疾病状态之间的不同蛋白质进行测量。Invitrogen 公司蛋白质组副总裁Cheri Walker 称：“用质谱仪器进行此类分析，能观察到很细微的变化，而2D凝胶是观察不到这些结果的。”
Invitrogen 公司计划将配对的试剂汇总起来一起使用。蛋白质表达系统可以对难表达的蛋白质进行表达，像膜蛋白质。Invitrogen 的Zoom Benchtop Proteomics系统，包括一个纯化蛋白质的微型胶格式和2D凝胶电泳。该系统进行样品分离，进行第一和第二向凝胶电泳，用MS兼容的染料染色。该系统使用Zoom Strips，窄范围条带为pH 4~pH 5.5。Zoom Strips具有更高的分辨率，良好的可见性，增强了聚焦能力，有利于减少蛋白复杂度。此外，独特的ZOOM Strip形式可以快速的再水化，分辨率更高，更加容易的鉴定聚焦在ZOOM Strips上的样品蛋白斑点。Walker称，公司10年前就存在的大的基因组学团队正快速的转变为蛋白组学研究团队，“他们正在寻找蛋白质研究的工具，因为这一平台还没有标准化。”
当前，越来越多的生物学家将高性能的色谱仪与MS一起联合使用。Agilent公司LC-MS市场经理Patrick Carberry认为MS的作用正在逐步加大，公司最近有一款LC与MS相结合、配备易用软件的新系统上市，价格在12.5万美元左右。
Agilent拥有许多技术，包括HPLC系统，最新的成员是一种HPLC芯片，能产生很窄的峰，比标准纳米柱的分辨率要好。公司正在开发一款用于蛋白质的系统方法。“我们已经开发了与MS和MS分析软件一起应用于蛋白质和肽的分离的设备和技术，信息、数据处理工具，将与普通的控制、应用和信息软件一起结合使用，并且是小型化的设备。”
深入蛋白质组研究
Beckman Coulter公司正对自己的技术和产品进行革新和改善。其标志性系统是ProteomeLab PF 2D，一种蛋白质部分分离系统，用2D色谱仪对目标样品进行分极分离，获得溶液状态的蛋白质。该系统同时具有蛋白质组的差异显示和样品回收功能，可以找出正常及疾病状态下蛋白质组谱的差异。可检测低丰度蛋白质，回收率提高，可最完整的保持目标蛋白的完整性和活性。
公司的ProteomeLab PA 800蛋白质鉴定系统可通过等电点和分子量对蛋白质进行分辨、定量。它可以为MS提供前端分离服用。ProteomeLab IgY能将血浆和血清中蛋白质量接近96%的12种最丰富的蛋白质分开。公司的目标是为研究人员提供更方便的工具，以进行更广泛的蛋白质研究。
（译自《Drug Discovery & Development》）
（来源： 来宝网 ）
文/Lori Valigra 美国剑桥市自由作家 译/贾芸
2005年6月，美国德克萨斯州一头奶牛经鉴定患疯牛病（学名为牛海绵样脑病，BSE），使得“蛋白质实验”荣幸的成为美国家喻户晓的名词。
最终鉴定结果的得出，既不是采用生物传感器，也不是其他的先进技术，而是古老的蛋白质转移吸印技术——Western blot，此前，美国农业部（USDA）采用酶联免疫吸附测定（ELISAs） 和免疫组织化学（IHC） 实验得出的结论是“不确定的和阴性结果”。之后，USDA和BSE世界标准实验室兽医实验所（VLA）进行了其他的额外实验，结果仍为阳性。德州奶牛事件使得美国农业部改变了自己的BSE实验计划。美国农业部动植物卫生检验局（APHIS）发言人Jim Rogers称，现在，在IHC和Western blot之后，都将进行ELISA试验，而不只是进行IHC试验。如果一系列实验之后确定试验是阳性结果，就可以认定样本为BSE阳性。
BSE事件再次证明了常规试验的重要性，同时也证明，天然蛋白质要比核酸复杂得多，因此蛋白质研究需要更多的工具。人类基因组测序的激烈竞赛，诞生了许多先进的基因组学工具。但是蛋白组学缺乏一种扩增技术，像用于DNA扩增的PCR技术类似的技术，因为蛋白质芯片与靶蛋白结合的条件很广泛，所以开发蛋白质芯片很难。这些原因使得ELISA、IHC、Western blot、一维（1D）和二维（2D）凝胶电泳以及质谱技术（MS）一直占据蛋白质检测市场，并且作为诊断、药物发现和开发的鉴定技术。目前，利用毛细管，这些技术得到了改进，加快了测试的速度，也有一些其他的附属技术例如液相色谱（LC） 与MS相结合使用，极大的便利了蛋白质检测。Cell Biosciences 公司CEO Linda Cahill说：“因为蛋白质很重要，所以人们才会不断的开发新技术。”
简化的Western blot
Western blot是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
自1979年Western blot问世以来，该技术几乎没有进行过改进，许多做过Western blot试验、已经毕业的研究生一想起那烦人的实验过程，都还会抱怨。实验过程是多么的复杂，像“如何从聚丙烯酰胺凝胶电泳中转移蛋白到一张硝酸纤维膜上，以获得一个可靠的原始凝胶图像的复制物。固化蛋白质不是在凝胶内部进行检测，而是通过抗体和许多分析过程进行检测。”但是，它确实是一项突破性技术，并且是一种重要的确定性分析方法。
Cahill曾对试验的普及性进行过一次调查，她对生命科学杂志进行了为期4个月的研究，对每一次的Western blot分析做了记录，在发表的文章中，与Western blot有关的文章高达85％。
虽然不断有新的蛋白质技术涌现，但Westerns blot的主导地位仍然无法撼动，因为它能对蛋白质进行分离，根据抗体可以得到更多的专一性结果。其实Western blot可以追溯到17世纪。Cahill说：“实验中需要多达100~200支不同的移液管，1~2天的手工操作过程，每一步都可能会犯错误，但是用它能进行分析实验。”
2005年夏天，Cell Biosciences公司开发了新系统——Blotless Nano Western 技术，只需要很少量的样本，就可以自动快速的得出检测结果，并且重现性好。Cahill称：“Western blot需要花费2天时间，而Blotless Nano Western只需要30分钟。”
该技术以毛细管免疫测定法为基础，可自动完成免疫印迹法的基本步骤，采用纳升容积，在毛细管里分离蛋白质。系统最初的进样量是500~1,000个细胞的一份样本，仪器能够同时进行多重毛细管操作。“我们要做的事情是确定蛋白质是否存在于样本中，它是否是一个好的药靶，如果不是，那么细胞中的蛋白质是怎么相互影响的呢？我们想弄清楚这些事情。”公司计划2006年初推出该产品。
更快、更灵敏的新技术
与Cell Biosystems公司的新产品相比，Western blotting分析需要50万个细胞，以及用于磷蛋白分化的高度特异性抗体。此外，需要2天时间才能完成一次实验，实验次数很有限。而Blotless Nano Western分析只需要不到4,000个细胞，将来可进行单细胞灵敏性分析。用一个抗体，一次试验就可以分离并检测磷和非磷物质。
Cahill称，用毛细管电泳进行试验，分离结果会更好，因为设备更容易控制。通过等电聚焦进行预分选，不只是根据蛋白质的大小进行分离，还根据蛋白质的电荷，因此，重现性好，周一早上进行的试验与周二下午进行的试验是一样的，这对生物学来说，很重要。Western blot技术能更多的用于确定BSE事件，市场潜力很大。
罗氏应用科学公司已经对Western blot技术作了一些改进，增加了一些方法和设备。公司的LumiLight和LumiLight Plus产品已经改善了化学发光信号的敏感性和持续性。罗氏产品经理Jeffrey Emch说：“我们很关注Western blot检测到的特殊蛋白质，但是用户对蛋白质进行检测和分离都很费劲。无论是学术界、医药界还是生物技术领域，这是主要的瓶颈之一。”
罗氏开发了快速翻译系统（Rapid Translation System）技术用于蛋白质的体外表达。它利用大肠杆菌或者是一种小麦胚芽溶菌液用于蛋白质生产。Emch 说：“当你在体外试验（试管内）中制造一种特定蛋白质时，你可以获得大量的此类蛋白质，但是从细胞体系中分离该蛋白质时，除了目标蛋白质，会有另外的蛋白质混杂其中，需要将目标蛋白质和其他蛋白质分离开，实际上就是减少杂质过程。”
改善凝胶
与Western blots一样，凝胶也让学生们为之烦恼：倒胶、染色、定量分析以确定蛋白质这一过程很费时间。Bio-Rad公司正在对多种产品进行改良，包括Western blots、1D 和2D凝胶。1D凝胶通过蛋白质的大小进行检测，并且通常与Western blots一起使用，2D凝胶则通过大小和电荷两方面检测蛋白质，一次实验可以观察上千种蛋白质。
Bio-Rad蛋白质分离部门经理Gustavo Salem说：“当前，2D凝胶仍然代表了最高的分辨技术，一次分析可对最大量的蛋白质进行分析。其他任何特异性技术无法取代2D凝胶，但可以继续对2D凝胶进行改善, 尤其是当它与样品制备有关时，可以为特殊蛋白质提供更好的分辨率。例如，在研究低丰度蛋白时，凝胶的清洁程度和重现性对样品制备步骤很关键。
哈佛大学化学生物学助理教授Gavin MacBeath认为，样本中有上千种不同的蛋白质，LC 和毛细管多维柱色谱（MDCC）与MS搭配使用，将为研究人员提供更多的方便。用MDCC与MS，“只需要很小的样本量，就可以深入研究蛋白质组的内容”。
Eksigent Technologies LLC 公司总裁Jeffrey Jensen希望人们不再使用2D凝胶技术，而是用色谱技术替换。该公司拥有多维LC分离产品，与质谱仪器一起使用时，能检测低丰度蛋白。为了获得低浓度蛋白，需要一个很低的流速，Eksigent称可以采用微流体控制（MFC）技术。MFC用计量器持续的检测每个流动相的流速，流动相有一个微处理器对压强做出反应，因此不需要气流分流就可获得低至20 nL/min的纳级别流速。样品无泄漏处理率高达99％以上，气流分流能控制流速，这样进入质谱仪的量就很少。
其他辅助技术
另外的趋势就是将不同的分离技术相组合，以分离特殊种类的蛋白质。例如，在一个离子交换树脂柱中，LC系统和凝胶结合使用具有纯化能力，然后，根据大小在凝胶上进行分离，最后进行质谱分析。近来，等电聚焦分离的需求越来越多，Bio-Rad公司的Rotofor系统可以与凝胶和LC一起使用。
此外，Invitrogen公司最近也开发了SILAC试剂用于蛋白质的鉴定和定量。通过1D 凝胶，SILAC可以纯合蛋白质，然后进入质谱仪分析。SILAC是一种新陈代谢标志性方法，能对处于正常和疾病状态之间的不同蛋白质进行测量。Invitrogen 公司蛋白质组副总裁Cheri Walker 称：“用质谱仪器进行此类分析，能观察到很细微的变化，而2D凝胶是观察不到这些结果的。”
Invitrogen 公司计划将配对的试剂汇总起来一起使用。蛋白质表达系统可以对难表达的蛋白质进行表达，像膜蛋白质。Invitrogen 的Zoom Benchtop Proteomics系统，包括一个纯化蛋白质的微型胶格式和2D凝胶电泳。该系统进行样品分离，进行第一和第二向凝胶电泳，用MS兼容的染料染色。该系统使用Zoom Strips，窄范围条带为pH 4~pH 5.5。Zoom Strips具有更高的分辨率，良好的可见性，增强了聚焦能力，有利于减少蛋白复杂度。此外，独特的ZOOM Strip形式可以快速的再水化，分辨率更高，更加容易的鉴定聚焦在ZOOM Strips上的样品蛋白斑点。Walker称，公司10年前就存在的大的基因组学团队正快速的转变为蛋白组学研究团队，“他们正在寻找蛋白质研究的工具，因为这一平台还没有标准化。”
当前，越来越多的生物学家将高性能的色谱仪与MS一起联合使用。Agilent公司LC-MS市场经理Patrick Carberry认为MS的作用正在逐步加大，公司最近有一款LC与MS相结合、配备易用软件的新系统上市，价格在12.5万美元左右。
Agilent拥有许多技术，包括HPLC系统，最新的成员是一种HPLC芯片，能产生很窄的峰，比标准纳米柱的分辨率要好。公司正在开发一款用于蛋白质的系统方法。“我们已经开发了与MS和MS分析软件一起应用于蛋白质和肽的分离的设备和技术，信息、数据处理工具，将与普通的控制、应用和信息软件一起结合使用，并且是小型化的设备。”
深入蛋白质组研究
Beckman Coulter公司正对自己的技术和产品进行革新和改善。其标志性系统是ProteomeLab PF 2D，一种蛋白质部分分离系统，用2D色谱仪对目标样品进行分极分离，获得溶液状态的蛋白质。该系统同时具有蛋白质组的差异显示和样品回收功能，可以找出正常及疾病状态下蛋白质组谱的差异。可检测低丰度蛋白质，回收率提高，可最完整的保持目标蛋白的完整性和活性。
公司的ProteomeLab PA 800蛋白质鉴定系统可通过等电点和分子量对蛋白质进行分辨、定量。它可以为MS提供前端分离服用。ProteomeLab IgY能将血浆和血清中蛋白质量接近96%的12种最丰富的蛋白质分开。公司的目标是为研究人员提供更方便的工具，以进行更广泛的蛋白质研究。
（译自《Drug Discovery & Development》）
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