分子生物学相关实验步骤及注意事项（二）

——反转录篇——

    反转录PCR（Reverse Transcription, RT-PCR）又称为逆转录PCR，是指扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。

（一）逆转录酶的种类

AMV：有较强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适42℃。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。

MMLV：有强的聚合酶活性，而RNA酶H活性较弱。较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。最适37℃。

Super RNaseH- Reverse Transcriptase：MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的模板合成较长的cDNA，最适42℃。（商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ）

GoScript Reverse Transcriptase：专为 qPCR 而设计，利用 M-MLV 和先进的缓冲液技术获得均衡稳定和可靠的 cDNA 合成结果，适合各种大小范围的低丰度和高丰度的转录子，即使存在抑制剂也不受影响。

    根据很多实验人员的经验反映，Promega的反转录酶效果杠杠滴，本人用过TaKaRa的，也是不错哒！大家可以根据自身情况进行选择。

（二）引物的选择

反转录引物有多种选择，Oligo(dT)、随机引物、基因特异性引物（GSP）等。

用来进行反转录的引物及其常用的推荐浓度如下表所示：

（表格引用Promega公司的 GoScript 反转录系统操作方法说明书）

（三）优化及注意事项

1. 逆转录PCR时，提取RNA是关键，需分离高质量RNA（纯度和完整性）。

2. 整个操作过程需使用祛RNA酶耗枪头及EP管。

3. 反转录过程中要谨防RNA酶的污染，加入RNA酶抑制剂。

4. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

5. 使用无RNaseH活性的逆转录酶

6. 提高逆转录酶保温温度

7. 减少基因组DNA污染

8. 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。 对于大多数反转录反应，建议加入氯化镁至镁离子终浓度为2.5 mM 以得到最佳结果，可在1.5到5mM范围内调整优化。对于长片段 RNA 的反转录，可以降低镁离子浓度以提高延伸的完整性；短片段RNA的反转录，可以提高镁离子浓度以提高反转录的效率。

下一期的荧光定量PCR篇，敬请期待！