图 1. 不同基因编辑手段的对比

2020 年，两位女性科学家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因发现 CRISPR/Cas9 基因剪刀，而获得 2020 年诺贝尔化学奖。

CRISPR/Cas 系统由一小段 RNA 和一种高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 组成的系统，该技术不像 TALENs 技术和 ZFNs 技术是依赖于蛋白与靶基因之间的识别，而是由 sgRNA 和靶基因之间形成复合物，从而完成特定基因序列的编辑。

CRISPR/Cas9 技术切割效率相对较高且操作简单，并且可以同时进行多位点的编辑。总之，三种不同的基因编辑技术都有其各自的特点。今天小 M 的“重头戏”，CRISPR/Cas9。

Cas9 蛋白包含两个核酸酶结构域：切割非互补 DNA 链的 RuvC 结构域和切割互补 DNA 链的 HNH 结构域 (如图 2a)。

噬菌体等外源 DNA 入侵时，CAS 蛋白复合物通常识别 3' 端含 NGG 的前间隔序列邻近基序 (PAM) 区域。然后，侵入的噬菌体或质粒释放的短 DNA 片段(称为 Protospacer)，插入宿主 CRISPR 位点中 (由重复序列隔开)。

CRISPR 序列转录，形成前体 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 与 pre-crRNA 上的重复序列配对形成双链 RNA 的条件下，对 pre-crRNA 进行剪切，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 双链 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。

当外源 DNA 再次进入细胞时，Cas9 蛋白携带sgRNA，去识别外源 DNA 的 Protospacer (前间隔序列)，并与之结合，通过 Cas9 解旋酶和核酸酶对靶基因进行剪切。造成靶基因 DNA 的双链断裂 (DSB)，从而达到干扰靶基因表达的目的，在修复断裂同时引入基因敲除或敲入。

图 2. 通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 内源性修复双链 DNA 断裂^[2]

■ 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略

可通过添加小分子来控制 Cas9 的构象变化，来实现对 Cas9 蛋白活性的时空控制。

案例 1：当内含肽插入 Cas9 蛋白的不同位点，Cas9 核酸酶失活；添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen)，通过构象变化和自切割反应去除内含肽，可重新激活 Cas9 蛋白（图 3a）。根据内含肽的插入位点，Cas9 的激活效率 3 倍到 10 倍不等，与野生型 Cas9 相比，这种调控策略可增加开/脱靶效应比率。

图 3. 小分子激活剂控制 Cas9 活性的策略^[9]

案例 2：基于化学诱导的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等人设计了不同的分裂位点 (Arg535 和 Glu573) 生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白，同时产生 C 端和 N 端Cas9 片段 (可分别与 FK506  结合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素结合结构域 (FRB) 结合)。这种方法通过雷帕霉素诱导的异源二聚作用实现了 split-Cas9 的条件重构和激活。

■ 小分子抑制剂控制 Cas9 活性的策略

由于 Cas9 活性的升高和持续可能会导致脱靶效应、染色体易位和遗传毒性，因此在目标编辑后，Cas9 核酸酶活性必须迅速限制在一个狭窄的时间范围内。

如下图 5 所示，DHFR (ER50)是一个不稳定的结构域，可快速靶向 Cas9 蛋白进行蛋白酶体介导的 Cas9 降解，但添加小分子抑制剂甲氧苄氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其稳定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系统编辑 VEGFA 基因时，用不同剂量的TMP 或 4OHT 剂量依赖性控制靶向 VEGFA 基因的复合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。

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