总RNA的提取、与realtime-PCR

 总RNA的提取、与realtime-PCR

一、实验原理

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。

由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。

1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶

但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。

外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。

2．常用的RNA酶抑制剂

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNase也有一定抑制作用。

3．防止RNase污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作

*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。

尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗

（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。（Northern Blot）

*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

二、仪器和试剂

1．仪器与器皿

超净工作台、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、移液器、电泳仪、凝胶成像系统、振荡器、各种吸头、EP管、研钵（或玻璃匀浆器）、镊子、剪刀、金属小勺、保温罐、液氮、乳胶手套。

研钵（或玻璃匀浆器）、剪刀、镊子、小勺等洗净后，锡箔纸包好200℃干烤6h；不耐高温的器皿（如各种吸头、EP管等）用0.1% DEPC水浸泡过夜（至少10hr以上），120℃高压20min灭菌和除去残留的DEPC，再烘干使用。

2．试剂

（1）无RNase纯水：0.1% DEPC处理过夜，高压灭菌。

（2）TRIzol RNA抽提试剂

（3）氯仿、异丙醇、70%酒精（RNase Free用无RNase水配制）

（4）10X凝胶缓冲液

吗啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）200mM， NaAc 100mM， EDTA（pH8.0）10mM，过滤除菌后避光保存。

（5）5X变性上样缓冲液：

水饱和的溴酚蓝16μL，500mM EDTA（pH8.0）80μL，甲醛（37%）720μL，甘油2mL，甲酰胺3mL，10X凝胶缓冲液4mL，加无RNase水至10mL，4℃可保持3个月。

三、Trizol试剂提取RNA操作步骤

1．准备工作

提取RNA前先打开冷冻离心机预冷，制好冰，用70%的酒精擦拭加样枪、离心管架和桌面，一次性手套，研钵，DEPC处理的tip、EP管等。

2．取材 

取新鲜动物组织，立即置于冻存管投入液氮中速冻，在液氮中可保存一年左右，-80℃可保存三个月。

3．组织样品的处理

研磨法：戴好厚手套和口罩，取约0.1~0.2g冻存组织，于液氮充分预冷的研钵中用力研磨，期间不断加入液氮，充分研碎组织，小心别把组织洒到外面。将组织粉末用小勺移入1.5mL的EP管中，立即加入1mL Trizol（或预先加入），剧烈摇匀15s，室温静置5min。组织或细胞可适当延长在Trizol中裂解的时间，能获得较多的RNA。

注意：样本体积不能超过Trizol体积的1/10。

匀浆法：取新鲜动物组织（或冷冻组织）0.1～0.2g迅速倒入匀浆器中，加入1mL预冷的Trizol，在冰浴中迅速匀浆20~30s然后将细胞悬液吸入另一EP管，室温静置5min。

细胞样品处理：贴壁细胞，完全除去培养液后直接向培养皿中加入1mL Trizol反复吹打几次，转入EP管，静置5min。

样本在Trizol中，-20℃至少可保存3天，-80℃可长久保存。

4．氯仿抽提

加入400μL氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，4℃，12000r/min离心15min，RNA分布于水相中。将上层无色水相转移到另一Ep管中，防止吸到中间层蛋白。若抽提不彻底，可加200μL氯仿重复抽提一次。

注意：EP管要作好标记，防止漏出的氯仿洗去标记；取上清遵循宁少勿烂的原则，保证RNA的纯度。

5．异丙醇沉淀RNA

加入800μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min（细胞RNA -20℃静置20min），4℃，12000r/min离心10min，即可观察到管底的RNA沉淀，小心倾去上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上2~3min除去残留的异丙醇。

注意：尽量吸净残余的液体，残余的异丙醇会影响后续的反转录和PCR扩增效率。

6．酒精洗涤RNA

加入0.7mL 无水乙醇+200µL DEPC水洗涤RNA沉淀物，4℃，8000r/min离心5min，弃上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上室温干燥3~5min。

RNA在75%的RNase Free酒精中，-20℃可保存两个月，-80℃可保存一年。

7．RNA溶解

向干燥过的沉淀物中加入20μL DEPC处理水（RNase Free水）50℃溶解10min，于-80℃保存备用。

RNA溶解前，尽可能除尽残余酒精，但也要防止过干，使RNA很难溶解。

溶解后的RNA容易被RNase降解，应尽量低温保存。为了防止痕量的RNase污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏等）中分离得到的RNA应贮存在甲醛中，以保存高质量的RNA。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中保存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA在水中保存三年仍保持稳定。

四、RNA的检测

1．在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

准备：DEPC水、RNase Free枪头、石英比色杯、冰盒、记录本，仪器（紫外分光光度计）提前预热30min。

用DEPC处理水校正零点；RNA样品提前按一定比例（如1:100）与DEPC水稀释好，充分混匀备用；读取稀释样品OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。每测定一个样品后用DEPC水清洗比色杯两次，再测定下一个样品。

RNA浓度的计算：单链RNA[ssRNA]=OD260×样品稀释倍数×40µg/mL

纯度较高的RNA样品OD260/OD280的比值通常在1.7~2.0，OD260/OD230的比值应高于2.0。OD260/OD280的比值若比值低于1.7说明有蛋白污染（Trizol处理时间过短，可用氯仿再次抽提）或RNA未完全溶解；若比值高于2.0表明有异戊醇或乙醇残留（羟基具有吸光度）。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

（1）制备凝胶（1.2%琼脂糖）：称1.2g琼脂糖，用DEPC水70mL加10×凝胶缓冲液10mL加热溶化，冷却至60℃后+甲醛18mL+5μL EB混匀后，制胶。

（2）RNA样品4μL+1μL 5×上样缓冲液混匀。

（3）换上新鲜电泳液，上样前凝胶预电泳5min，随后将样品点入胶孔。以6-10V/cm的电压，跑30min左右，凝胶成像仪照相。

也可用普通新鲜电泳缓冲液配制凝胶，250V高压电泳5min，迅速照相。

（4）在凝胶成像系统中分析

动物RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S（某些试剂盒提取的RNA看不到5S条带）RNA条带，则说明完整性好，各条带清晰无拖带且28S和18S的亮度比约为2:1，表明RNA无降解，反之则表明RNA样品有较严重的降解。如果在28S后边还有条带，表明基因组DNA污染，可用DNase处理后再进行纯化。

注意：为了防止RNase污染，提RNA操作宜快，动作轻，尽量避免空气流动，不可大声喧闹，手套勤换，避免汗液。

五、RT –PCR

1. RNA反转录（RT）

一般以25μL体系加入0.5~2μg总RNA进行RT。推荐使用1μg总RNA进行RT。

（1）去RNA模板二级结构

依次加入10μM Oligo dT 1μL +总RNA 1μg（1-2μL）+DEPC水8μL，混匀，70℃水浴5min（使模板二级结构解开），迅速至冰上骤冷2min（防止重新形成二级结构）。

（2）再按顺序加入各试剂（针对Promage M-MLV M531A反转录酶）

5×M-MLV Reaction Buffer 5μL + RNAsafe(30U/μL) 1μL + M-MLV RT(200U/μL) 1μL + dNTP(2.5mM each) 5μL + DEPC水补足25μL 混匀。

（3）RT

混匀RT体系，离心数秒，42℃（延伸37-42℃均可）水浴60min合成cDNA。

（4）灭活反转录酶

80℃ 5min灭活，-80℃保存RT产物，防止多次冻融。

较多样品RT时推荐方法：

2. RT-PCR

推荐RT前留一部分RNA做为基因组污染对照，即，不加cDNA，直接以总RNA为模板PCR，如果能扩出条带，说明有基因组污染，且影响到目的基因表达量的检测；另外一种对照是用超水作为模板PCR，目的是检测所使用的各种PCR试剂是否有污染。

（1）引物

在NCBI中找到目标基因mRNA序列，利用Oligo 6.0 或 Primer 5.0软件设计引物，也可直接利用NCBI提供的Primer-Blast软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计引物。

普通RT-PCR引物扩增产物应控制在150-500bp，RealTIme PCR引物扩增产物应控制在80~300bp，较容易检测。引物序列设计完成，通过E-mail发送到上海生工序列合成邮箱（上海合成部：synth@sangon.com 北京合成部：beijing@sangon.com），一般2-3天即可合成送达。

新合成的引物，先离心（12000rpm 5min使管壁上的核酸粉末沉到管底），按照说明书推荐的溶解体积（一般1OD引物需加水50μL左右）加入灭菌超纯水（或TE），溶解到100μM，涡旋混合数秒使引物充分溶解，再次离心，-20℃保存。PCR时一般使用的引物浓度为10μM，因此，使用前须稀释十倍。

RT-PCR对基因表达进行相对定量分析需要跟一个表达稳定的内参基因进行比较，除了要设计目的基因引物还需要一个内参基因引物（一般选择Gapdh或β-actin作为内参）。

（2）半定量PCR体系

PCR循环数：根据基因表达丰度而定，一般在初次做时先设置较高的循环数（35-40cycles），然后逐步减少循环数（一般每次减少2个循环）筛选基因扩增的对数期和平台期循环数。一般选择基因PCR对数期范围内的扩增循环数（促进基因表达的处理处于PCR平台期前的循环数最好）进行基因相对表达差异的比较。

电泳检测：将不同处理的样品RNA的RT-PCR产物进行琼脂糖电泳检测，比较条带灰度值（目的基因比内参基因条带，得到基因表达的相对值），不同处理间基因相对表达量差异即可得出。

（3）RealTime PCR

针对TakRa SYBR Green Realtime PCR Kit （SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

加样方法：根据实验设计（试验处理数和检测基因数）确定所加样的管数。一般每个处理做两管平行。

需加样数= 处理数×检测基因数×2

提前准备好冰盒、96孔管架2个。

先按照加样数计算出SYBR Green Premix Ex Taq、Rox Reference Dye II 和dd H2O的量（最好多预算出1~3份试剂的量，否则到最后就不够分装），并按照相应的量在1.5mL 的EP管中混好。→ 然后按照试验的处理数平均分成若干份（几个处理就分几份）分装到0.5mL的EP管。→ 然后，分别添加各处理的cDNA并做好标记防止互相混淆。→ 样品混匀后，再将每管按照所需检测的基因数平均分成若干份于0.2mL的EP管中，分别添加相应的引物，并做好标记。→ 每管样品按两个平行（20μL/管）分装到ABI公司生产的RealTime专用八连管或96孔板

（一定记住每个处理、检测的基因位于96孔板的位置，Realtime检测管不能做标记，最好提前在实验本上设计好每个检测管的位置，防止混乱）

样品加完后装入Realtime PCR仪样品台（记住每个处理和基因的位置），打开电脑，设置如下（以AB7500为例）：运行Realtime PCR仪控制软件

Instrument 选项卡设置

保存后点击 Start 按钮开始运行。运行时间约2h，结束后点击，命令栏的播放按钮，然后点保存按钮即可。 此时可以点击Results选项卡查看，Realtime运行数据，包括扩增曲线、引物溶解曲线等。

结果分析：

点击新建按钮 在Assay选项列表中选择ddCt(Relative Quantitation) Study命令，Next → 点击Add Plate按钮，选择已保存的ddCt(Relative Quantitation) Plate文件（.sds文件）Finish。

点击运行按钮，然后选择左侧窗口所列的基因，点击Gene Express选项窗口，即可查看基因相对表达量的柱形图。