HPLC／MS／MS测定恒河猴血浆中纳曲酮及其代谢物纳曲醇的浓度

[摘要]目的：建立高效液相色谱-质谱联用法测定恒河猴血浆中纳曲酮及其代谢物纳曲醇的浓度。方法：液相色谱：色谱柱为Nucleocil ODS(5μm，50mm x2.0 mm)，流动相为乙腈-甲醇-水-冰醋酸(2O：2O：60：1)，流速为0.2 mL/min；质谱：离子源为Turbo Ionspray源，采用多反应监测(MRM)方式进行检测，m／z 342.3-324.3(纳曲酮)、m／z 344.3-3266(纳曲醇，代谢产物)、m／z 328.4-31O.4(纳洛酮，内标)。样品经有机相提取纯化后进样。结果：纳曲酮和纳曲醇的线性范围分别为0.098-150 ng/mL 和0.781-25 ng/mL，萃取回收率均大于75％ ，日内误差(RSD)均小于9.3％，日间误差(RSD)均小于12％。结论：本方法准确、快速、灵敏、专属性好，适用于动物试验及临床上测定血浆中纳曲酮及其代谢物纳曲醇的浓度和药代动力学研究。
Determination of Naltrexone and Its Metabolite Naltrexol in Rhesus Monkey Plasma by HPLC／MS／MS YUAN Mei，GUO Ji-fen，WEI Shu-xiang and ZHANG Zhen-qing
Abstract Objective：To establish an HPLC／MS／MS method for the determination of naltrexone and its metabolite naltrexol in rhesus monkey plasma．Methods：LC：Nucleocil ODS column(5 μm，50 mm×2．0 mm)，the mobile phase consisting of acetonitrile—methanol—water—acetic acid(20：20：60：1)，a flow rate of 0．2 mL/min ．injection volume 20 μL；MS：Use Turbo Ionspray，and the multiple reaction monitoring(MRM)mode，m／z 342．3-326．3(naltrexone，NTX)，m／z 344．3-326．3(naltrexol，NOL，metabolite)and m／z 328．4-310．4(naloxone．NLX，internal standard)．Samples were extracted with benzene—ethanol(9：1)． residues Was dissolved in 100μL of water—acetic acid(100：1)and injected．Results：The linear range of NTX Was 0．098-150 ng/mL。The linear range of NOL Was 0．781-25 ng/mL． The extraction recovery rates were more than 75％ intra—day RSD Was less than 9．3％ ，and inter—day RSD was less than 12％ ．Conclusion：The established method is accurate rapid，sensitive and specific．Such method is suitable for application in the determ ination of NTx an d its metabolite NOL and investigation of NTX pharmacokinetics．
纳曲酮是阿片受体拮抗剂，主要用于治疗阿片类依赖，防止阿片类依赖者脱瘾后的复吸。但是每天坚持服药对那些阿片类依赖者来说是很困难的事情，为了减少其顺应性的无常变化，我们开发研究了纳曲酮微球注射剂。有关纳曲酮体内浓度的测定方法已有文献报道，采用GC／MS、电子捕获气相色谱法 、电化学检测高效液相色谱法、HPLC-UV 等。本实验采用HPLC／MS／MS法，不仅仪器操作在实验室很容易满足，而且通过对药物二级碎片离子的检测，大大提高了方法的灵敏度和专属性。我们将该方法应用在恒河猴体内的药代动力学及缓释特性的研究，旨在为该制剂的临床过渡和应用提供参考依据。
1 仪器及试剂
美国Agilent公司Agilent 1100高效液相色谱仪和美国ABI公司API3000质谱检测器，配有Turbo Ionspray源及Analyst 1．1数据处理系统。LD5—2A型医用离心机(北京医用离心机厂)、震荡器(Type16700 Mixer；Thermolyne)、MiHi Q RG纯水机及SartoriusBS1 10S万分之一分析天平等。
盐酸纳曲酮对照品(碱基缩写NTX)，批号：010626，盐酸纳曲醇对照品(碱基缩写NOL)，批号：010725，均由军事医学科学院毒物药物研究所合成室提供，纯度>99．5％(高相液相色谱法测定)。盐酸纳洛酮(内标，碱基缩写NLX)，纯度>99％ ，批号：Lot 48H1160，Sigma公司产品。碳酸氢钠、氢氧化钠、苯、正丁醇均为市售分析纯；乙腈和甲醇为色谱纯，Fisher Chemicals；冰醋酸，Tedia公司；水为重蒸馏水。
2 实验方法
2．1 测定条件
2．1．1 色谱条件
色谱柱：Nucleocil ODS(50 mm×2．0mn，5μm)，澳大利亚SGE公司；柱温：室温(23℃)；流动相：乙腈-甲醇-水-冰醋酸(20：20：60：1)；流速：O．2 mL/min。
2．1．2 质谱条件
离子源：Turbo Ionspray源；扫描方式：正离子扫描；NEB：6；CUR：10；CAD：6；IS：4OO0．0 V；TEM：300．0 oC；采用多反应监测(MRM)方式检测，m／z 342．3-324．3(NTX)、m／z 344．3-
326．6(NOL，代谢产物)、m／z 328．4-3lO．4(NLX，内标)。
2．2 溶液配制
2．2．1 对照品溶液和内标溶液
精密称取盐酸NTX和盐酸NOL适量，分别溶于水，均配成1 mg/mL 的对照品储备液。精密称取盐酸NLX适量，用水溶解后稀释成200 ng/mL 的内标溶液。储备液和内标溶液保存于4℃冰箱。临用前精密吸取NTX和NOL的对照品储备液并分别稀释成1．95，7．81，31．2，125，50p，1000，3000 ng/mL 和7．81，15．6，31．2，125，250，500，1000 ng/mL 浓度系列的标准工作液。
2．2．2 碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲溶液(pH=9．4)
称取碳酸氢钠4．20 g，加入100 mL水溶解成0．5mol/L 碳酸氢钠溶液，加0．2 mol/L 氢氧化钠溶液调至pH=9．4。
2．3 生物样品处理
待测血浆1．0 mL，加入内标溶液5O ，涡旋振荡2 S，再加入碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲溶液(pH=9．4)0．25 mL，涡旋振荡5 S，然后加入苯一正丁醇(9：1)5 mL，涡旋振荡2．5 min，离心(3000 r/min，7 min)后转移有机相至收集管中，置5O℃水浴中，氮气流吹干，残渣用水-冰醋酸(100：1)100 μL使溶，取2OμL进样。
3 实验结果
3．1 色谱行为 图1为按方法中选定的LC／MS／MS条件，测得空白血浆及血浆样品的色谱图。由图1可见血浆中杂质在本实验条件下对NTX和NOL与内标的定量分离测定无影响。
3．2 生物样品中NTX和NOL线性关系 空白血浆1．0 mL，加入不同浓度的NTX和NOL对照品溶
液5Oμ L及内标溶液5OμL，使血浆样品浓度分别为NTX：0．098，0．391，1．56，6．25，25，50，150 ng/mL ；NOL：0．391，0．781，1．56，6．25，12．5，25．50ng/mL。按“实验方法”所述进行样品处理、测定。以血浆中NTX和NOL与内标峰面积之比为纵坐标，NTX和NOL浓度为横坐标，直线回归。结果表明血浆中NTX和NOL的线性范围分别为0．098—150 ng-mL 和0．781—25 ng/mL：线性方程分别为：Y=0．189X +0．00597 r=0．997l Y=0．154X +O．oo955 r=0．9913血浆样品中NTX和NOL的最低定量限(n=5)分别为0．099士0．008 ng/mL ( X±SD)和0．701士O．060 ng/mL (X±SD)。
3．3 回收率和精密度
空白血浆1．0 mL，加入3种不同浓度的NTX和NOL对照品溶液及内标溶液各50μL，使血浆样品浓度分别为NTX：0．195，3．12，50 ng/mL；NOL：0．781，3．12，12．5 ng/mL。按“实验方法”所述，进行样品处理、测定，用其峰面积与相应浓度对照品溶液直接进样得到的峰面积进行比较，测得萃取回收率(n=5)，低、中、高3个浓度回收率分别为NTX： 92．4％ ， 85．4％ ， 91．5％ ； NOL： 98．1％ ，76．7％ ，97．7％ ；RSD分另0为NTX：6．8％ ，5．2％ ，4．8％ ；NOL：3．1％ ，5．5％ ，7．3％ 。按同样方法配制出上述低、中、高3种浓度的血浆样品，按“实验方法”所述，进行样品处理、测定，以考察方法日内精密度和日间精密度。结果(n=5)日内RSD分别为NTX：9．3％ ，2．0％ ，3．6％ ；NOL：4．2％ ，2．5％ ，3．2％ 。日间RSD分别为NTX：10．9％ ，5．6％ ，4．9％ ；NOL：12％ ，9．4％ ，8．1％ 。
在样品提取方法方面，参考了有关文献 并对其方法进行了改进，将原来多次提取改为单次大体积有机溶剂的提取，这样不仅操作简便，节省溶剂，而且回收率高，能够满足体内低浓度药物测定和药代动力学研究。NTX体内代谢转化存在种属差异，本实验以恒河猴作为受试动物，主要考虑NTX的体内代谢性质以恒河猴和人比较接近，原形药物可代谢生成NOL，药理实验表明这一产物仍具有药理活性，所以本实验在检测NTX的同时检测NOL是很有必要的，考虑NOL的药理作用强度低于NTX数倍，NOL的代谢生成量远低于NTX，其较低的浓度在体内也不会产生有效影响，故NOL的定量下限仅测到0.781 ng/mL。
参考文献
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