HIV的流行概况及其实验室检测技术

　一．HIV/AIDS全球流行概况
　　
　　据联合国艾滋病规划署（UNAIDS ）2004年最新发布的全球AIDS流行报告报道：在2003年，近500万人新近感染了HIV，是艾滋流行以来感染人数最多的一年。在全球水平，存活的感染了HIV的人数仍在继续增长，由2001年的3500万增至2003年的3800万。同一年，近300万人死于艾滋病，自从1981年第一例艾滋病病人被诊断以来已经有超过2000万人死于此病。但是，在不同的区域内艾滋病的流行规模和影响不同。具体数据见表1。

地　区	活着的ＨＩＶ感染人数	2003新增ＨＩＶ感染人数
亚洲	740万	110万
撒哈拉南部非洲	2，500万	300万
北非和中东	48万	不详
东欧和中亚	130万	不详
拉丁美洲	160万	不详
加勒比海国家	43万	不详
高收入国家	160万	不详
总　计	3，800万	约 500万

• 非洲：仍是全球HIV/AIDS威胁最严重的地区。撒哈拉南部非洲占世界人口的10％,但却有着世界上三分之二的活着的HIV感染者
• 南亚和东南亚：是第二个HIV感染严重的地区,静脉吸毒者、妓女和男性同性恋者是该地区主要的感染人群。亚洲拥有世界上60％的人口，艾滋在亚洲的快速增长对世界将产生深远的影响
• 在北非和中东的大多数地区，HIV感染集中于静脉吸毒者等高危人群中
• 在东欧和中亚，该地区流行的主要原因仍然是静脉吸毒，但在该地区的一些国家中，性传播途径越来越普遍
• 在拉丁美洲，HIV的流行集中于HIV感染高危人群——静脉吸毒者和男性同性恋者
• 在中美洲，HIV主要通过性行为传播，包括异性和男性同性恋
• 在加勒比海国家，HIV主要是通过异性传播。受影响最深的国家是海地，其流行率约5.6％，是在非洲以外的国家中最高的
• 在高收入国家，西欧和北美，大多数存活的HIV感染者能够得到抗逆转录病毒治疗，因此他们能保持健康的状态并且比其他地区的感染者存活更长的时间

　　总之,世界所有地区的HIV／AIDS仍在蔓延,而且有些地区(南亚和东南亚,以及西太平洋地区)流行比较严重。而西欧和北美则已经得到高效抗逆转录疗法(HAART)的益处,HAART可大大减慢由HIV发展成为AIDS以及AIDS死亡的进程。

　　二．中国HIV／AIDS流行概况
　　
　　 自1985年我国发现第一例艾滋病病毒感染者，HIV／AIDS已从局部流行进入广泛流行的快速增长期，截至2001年底,全国共报告HIV感染者30736例,其中AIDS病人1594例。我国约有84万艾滋病毒感染者，只有5％的携带者可以明确定位，发病的有8万人。按人口比例计算,与世界其他HIV感染高发地区相比,我国HIV的总感染率虽尚属低水平,但考虑到我国幅员辽阔,人口众多,其潜在感染者的巨大数量必须得到重视。以静脉注射毒品为主要传播途径(占71.7％)是我国HIV流行的特点。

　　三．经输血传播HIV／AIDS的风险
　　
　 全世界在成人HIV感染者中,经输血/血制品感染者约占3％～5％,不同国家和地区,尤其是发达国家和发展中国家之间的流行状况存在较大差异。如欧美等发达国家,经输血传播HIV的危险逐年降低,已降至1/440000～1/660000以下。而在很多发展中国家,流行趋势尚无明显的下降,在亚洲、非洲、拉丁美洲的一些国家甚至还呈上升趋势。目前,发展中国家5％～10％的HIV感染源于输血/血制品,经输血途径传播HIV的危险性依然很高。在我国由于非法采浆，输血相关的AIDS曾是我国某些地区HIV传播的主要途径之一。

　　四．HIV的实验室检测技术
　　
　　HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组（图1）。迄今为止，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2型：HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型内，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为三个组：Ｍ组（主要组）、Ｏ组（外围组）和Ｎ组（新组或非M非O组），Ｍ组内又可分为Ａ-Ｊ10个亚型。在HIV-1型和HIV-2型之间,其核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反应。应用免疫印迹法(West blot)可以将二者明确地区别开来。

　　早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间接地诊断HIV感染。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图1 HIV病毒结构示意图

　　1．免疫学方法

　　HIV抗体一般在人感染后几周逐渐出现,可延续至终生，血清学试验分为初筛和确认试验。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验(WB)。

免疫学方法	HIV抗体检测 常规实验方法： 酶联免疫吸附试验(ELISA) 免疫印迹试验(WestBlot) 间接免疫荧光法(IFA)　 快速检测方法： 明胶颗粒凝集试验　 斑点免疫结合试验　 HIV抗原检测　 Ｐ24抗原的检测
分子生物学方法	RT－PCR检测法 荧光实时PCR检测技术 支链DNA（bDNA） 连接酶酶促链式反应(LCR) 核酸序列依赖性扩增(NASBA) 转录介导的扩增(TMA)
细胞培养与检测	淋巴细胞培养

　　1.1　酶联免疫吸附试验(ELISA)
　　　　ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。
　　　　第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。
　　　　第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。
　　　　第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。
　　　　第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。

代数固相包被物偶联物检测特异性

第一代HIV-1全病毒裂解物抗人IgG的二抗抗HIV-1 IgG 第二代HIV-1/-2人工重组抗人IgG的二抗抗HIV-1/2 IgG 或化学合成多肽抗原 第三代HIV--1/-2/-0人工重组或HIV--1/-2/-0人工重组或抗HIV-1/-2/-0 化学合成多肽抗原化学合成多肽HIV抗原IgG/IgM 第四代HIV--1/-2/-0人工重组或HIV--1/-2/-0人工重组或抗HIV-1/-2/-0 化学合成多肽抗原化学合成多肽HIV抗原IgG/IgM 及抗Ｐ24抗原抗体及抗Ｐ24抗原抗体及Ｐ24抗原

图2 四代试剂的反应示意图

　　窗口期是HIV检测过程中涉及到的一个重要概念，HIV的窗口期是指虽有HIV感染,但实验室检测为阴性的一段时间，它的长短直接取决于检测试剂的质量。关于窗口期排查时间，目前医学界存在很多争论，有说6～8周的，也有说3个月的，最保守的说法是6个月，国内比较认同的说法是3个月，超过3个月检测结果仍为阴性者，可以排除HIV感染的可能性。由于病毒检测的窗口期问题的存在，输血导致HIV/AIDS的传播仍是不可避免的。但随着检验方式的进步和检验试剂的改进，窗口期已经大大缩短，极大地降低了输血传播HIV/AIDS的可能性（图3）。

　　图3 不同检测方法和不同检测试剂检测的窗口期
 

　　 从图3中可以看出每一代试剂的改进都会缩短窗口期，其中与第三代试剂相比,第四代试剂检测窗口期平均缩短了4～5天。

　　1.2 免疫印迹试验（WB）
　　免疫印迹试验主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS-PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2％的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

　　1.3 免疫荧光试验(IFA)
　　基本原理为应用Ｈ-9或HUT-78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定，制备为抗原片,加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

　　1.4 明胶颗粒凝集试验(PA)
　　PA的基本过程是先将样品稀释,然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒,混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。

　　1.5 斑点印迹试验(或免疫层析/或渗滤)
　　斑点印迹试验一般采用硝酸纤维素膜作固相载体, 用HIV抗原包被于固相载体,加入待测标本(可为血清,血浆,尿液和其它体液),一定温度反应后洗去未结合于固相载体上的标本,包被抗原和被检血清中抗体结合,用胶体金(或胶体硒)代替底物连接在葡萄球菌蛋白Ａ上,金标记蛋白Ａ具有与人Ig结合的能力,因而可与被捕获的HIV抗体结合。若样品中有HIV抗体,则薄膜上就会产生一桔红色斑点(或线条),一般3～10 min出结果,特异性较好, 较为适宜于偏远地区临床用血检测,但不适于城市地区的献血员筛查。

　　1.6 HIV抗原检测
　　HIV抗原通常检测的是 Ｐ24抗原，采用的方法通常为夹心法ELISA, 具体过程大致为:将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底,当加入待测血清后,若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物,再加入酶(HRP)标记的HIV抗体,在抗原上又结合了酶标记的抗体,加底物显色后,在酶标仪上读结果，其敏感度约为50～100pg/ml标本浓度。

　　2．分子生物学方法

　　随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比Ｐ24抗原检测方法更灵敏。

　　2.1 多聚酶链反应（PCR）检测法
　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
　　① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
　　② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
　　③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIV-RNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT－PCR。

图4 RT－PCR示意图

　　2.2 实时荧光定量PCR技术
　　实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

图5 实时荧光定量PCR技术示意图

　　本技术的原理（图5）是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′-3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。

　　2.3 支链DNA检测法—ｂDNA
　　ｂDNA是定量检测血浆中的HIV-1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成了HIVRNA-寡核苷酸复合物。再加入一种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR，提高bDNA灵敏度是一大难点。

　　2.4 核酸序列依赖性扩增法－NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)
　　NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42℃进行 ,可在 2h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶Ｈ、Ｔ7RNA聚合酶和引物进行扩增 [16]。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物Ｉ与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火, 在反转录酶作用下合成第二条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量扩增（图6）。

　　图6 NASBA法示意图
(Reesink HW.HepatitisCVirus.KARGER,1998:79)

　　2.5 转录介导的扩增技术—TMA(Transcription mediated amplification)
　　TMA技术原理与NASBA基本一致(图6，7)，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶Ｈ活性。反应在 41.5℃进行 ,可在 1h内将RNA模板扩增约 109倍。

TMA技术示意图

　　2.6 连接酶酶促链式反应(LCR)
　　LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。

 　　　　　

　　　　　　　　　　　图7 连接酶酶促链式反应图　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　　以上介绍的几种核酸检测方法各有其特点（见表4）

方法	靶分子扩增	信号扩增	温度循环	敏感性
PCR LCR NASBA B－DNA	对数扩增 不扩增 对数扩增 不扩增	不扩增 对数扩增 不扩增 线性扩增	是 是 否 否	高 高 高 中

　　3．细胞培养与检测

　　常规方法是将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养, 经适当周期培养后测定培养液HIVｐ24抗原, 进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。细胞培养方法与血清学方法相比,专一性很强,不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR, 因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。

　　以上简述了HIV的流行概况和实验室的检测技术，相信随着HIV实验室检测技术的不断的改进，尤其是核酸检测技术的不断应用，HIV检测的窗口期将会逐步缩短，经输血传播HIV可能性也将会大大减小。

参考文献

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