应用红外光谱分析技术研究微波辐照对心肌细胞的损伤

应用红外光谱分析技术研究微波辐照对心肌细胞的损伤
宋占军1 邓 桦2 王德文2 刘炳玉1 郑永红1
（1.国家生物医学分析中心,北京100850；2. 军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850）
[摘要] 目的：应用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）分析大鼠乳鼠的原代培养心肌细胞受高功率微波（high power microwave, HPM）辐照前后的细胞结构改变情况。方法：将培养的心肌细胞分为3组，分别用高功率微波辐照30s、60s、120s，然后在傅里叶变换红外光谱仪的红外显微镜上测定每组细胞的红外光谱。结果：发现大鼠乳鼠原代培养心肌细胞受高功率微波辐照后，细胞膜的结构发生了明显的改变。结论：傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析技术可用于了解大鼠心肌细胞受微波辐照后细胞膜中蛋白质构象变化，尤其是测定细胞膜蛋白二级结构的变化信息。
[关键词] 傅里叶变换红外光谱 高功率微波 心肌细胞 蛋白质二级结构
[中国分类号] [文献标识码]
[文章编号]
Applying infrared spectroscopy analysis technology to research the injury of the cardiac muscle cell irradiated by microwave.
SONG Zhan -Jun , DENG Hua , WANG De-Wen
(National Center of Biomedical Analysis ,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850 , China;Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850 , China)
[Abstract] Objective: Applying Fourier transform infrared spectroscopy ( FTIR ) analyses in cell structure change that the primary cultured newborn rats cardiac muscle cells irradiated by high power microwave (HPM ). Method: The cardiac muscle cell is divided into 3 groups, and irradiated by HPM with 30s, 60s, 120s respectively, then measuring the infrared spectrum of each group on the infrared microscope of FTIR instrument. Result: After irradiation by HPM, the structure of cardiac muscle cell membrane changed markedly. Conclusion: FTIR analysis technology can research protein conformation‘;s change in the cell membrane of the cardiac muscle cell when suffering HPM irradiation, especially to study the change information of protein secondary structure of cell membrane.
[Key words] FTIR; HPM; cardiac muscle cell; protein secondary structure
流行病学调查和实验研究已证实，微波辐射可对人体健康造成广泛影响。其中心血管系统是电磁辐射损伤的易感器官之一。电磁辐射可引起心血管系统功能紊乱和组织细胞损伤，在临床上出现心电图波形异常、心区疼痛等症状，但对其损伤效应尚缺乏系统研究，其致伤机制至今尚未完全阐明。本实验使用高功率微波（high power microwave, HPM）辐照原代培养心肌细胞的方法，采用付里叶变换红外光谱技术，对电磁辐射对心肌细胞膜的影响进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 仪器
Bio-Rad FTS-65A傅里叶变换红外光谱仪/UMA500红外显微镜；高功率微波辐照源（军事医学科学院放射医学研究所提供）：频率9GHz，波长3.2cm，峰值功率密度950mW/cm2，脉宽0.35μs。
1.2 照射方法
心肌细胞分为对照组和照射组。照射组又分为3个剂量组，照射时间分别为30s、60s、120s。
1.3 心肌细胞培养
1～3d 的二级Wistar 大鼠乳鼠（军事医学科学院动物中心提供）。于无菌条件下取乳鼠心室肌。剪成约1mm3的碎块。加入适量1：1比例的0.1% 胰蛋白酶消化液和0.02%EDTA-Na，混合消化5min，轻轻吹打，弃第一次上清液（因含较多血细胞）。继续用上述混合消化液消化数次，每次约10min，轻轻吹打后，吸取上清液即细胞悬液。细胞悬液立即用含15%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。重复上述步骤，直至将心室肌碎块完全消化。将收集的细胞悬液离心， 1500r/min×5min，弃上清液。加适量DMEM，吹打，200目筛网过滤。将上述细胞悬液置入100ml 培养瓶，入37℃ 5%CO2培养箱，培养90min后，将细胞悬液轻轻吸出，用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养于CaF2窗片，密度约为2×106。于培养的前72小时，在DMEM培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的BrdU。培养24h即可见心肌细胞的自律性搏动，5d后进行高功率微波辐照。
1.4 细胞样品准备
HPM照射后即刻终止细胞培养，用0.9%NaCl溶液收集刮下的细胞滴在特制的镀金片上，放置在干燥器中真空干燥，供光谱测试用。
1.5 FTIR光谱的测定
红外光谱在Bio-Rad FTS-65A傅里叶变换红外光谱仪/UMA500红外显微镜上测定，仪器由干燥净化空气吹扫，以降低水气吸收的干扰。分辨率为4cm－1，使用液氮冷却的MCT检测器，红外检测光栏为50μm×50μm，每个样品扫描128次，获得原始红外光谱。
1.6红外光谱的处理
将原始红外光谱与同样条件下测得的背景红外光谱做差谱处理，差减以保证在2000～1700 cm－1之间无吸收峰特征。导数和去卷积采用Bio-Rad FTS-65A 3200 Date Station软件。在光谱的二级导数中，Boxcar切趾函数的带通边参数取值0.4-0.6，傅里叶去卷积采用 Bessel切趾函数，洛仑兹半高宽16 cm－1，分辨率增强因子（k）为2.3。对去卷积谱的谱带拟合采用BANDFIT程序，以洛伦兹+高斯谱带拟合，各组分的相对含量由最终拟合的酰胺Ⅰ谱带面积计算得到。
2结果
2.1样品原始红外光谱的谱带归属
对照组和照射组乳鼠心肌细胞的红外光谱见图1。根据从细胞和组织中分离出来的核酸、蛋白质、糖、酯及其他生物大分子的红外光谱研究[1,2 ,3]，对照组乳鼠心肌细胞主要的吸收谱带及归属如下：
3271 cm－1和3071 cm－1为NH伸缩与酰胺Ⅱ第一倍频共振吸收。
2956 cm－1、2871 cm－1为膜脂质末端和膜蛋白中 -CH3 的伸缩振动峰。
2925 cm－1、2854 cm－1为脂质中 -CH2- 的伸缩振动峰。
2960 cm－1归属于蛋白质、脂类和DNA的-CH3 伸缩振动峰。
1736 cm－1为细胞膜中磷脂结构中C=O基团的伸缩振动峰
1624 cm－1和1534cm－1为蛋白质的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带；
1451 cm－1为膜脂质中 -CH3 和 -CH2- 非对称弯曲振动峰。
1397 cm－1为 -CH3 对称弯曲振动峰。
1238 cm－1和1169 cm－1为细胞膜中磷脂磷酸二酯基团的对称伸缩振动。
1083 cm－1主要由糖类C—O基团伸缩振动引起；
图1 对照组和照射组乳鼠心肌细胞的红外光谱，虚线：对照组；实线：照射组
比较照射前后乳鼠心肌细胞的红外光谱差异可以看出：照射后乳鼠心肌细胞的红外光谱，在1736 cm－1处属于细胞膜中磷脂结构中C=O基团的伸缩振动峰消失。说明鼠心肌细胞膜中磷脂的构象发生了改变，膜脂质发生相变。磷脂分子碳氢链处于凝胶态，碳氢链间相互作用增强，从而反应了膜脂的流动性下降[4]。2933 cm－1、2854 cm－1为脂质中 -CH2- 的伸缩振动峰强度明显减弱并向高波数位移，有可能是因为细胞膜中磷脂分子碳氢链构象的无序化和扭式构型增加所致[5,6]。
2.2 乳鼠心肌细胞中蛋白质二级结构的分析
蛋白质是由氨基酸以酰胺键共价连接而成的多肽链构成的，同一多肽链或不同多肽链之间还以二硫键形成侧链共价交联。蛋白质的二级结构是指蛋白质中多肽的规则排布，由主链极性基团的氢键形成，常见的二级结构有a螺旋、b折迭、b转角等。这些结构或其它构象都有其特定的氢键结构，而这些氢键结构的差异可以通过红外光谱得到反映，主要表现为谱带峰位及半高宽的变化。一般蛋白质和多肽的傅里叶变换红外酰胺Ⅰ谱带去卷积谱包含9～11个子峰，由二阶导数谱确定各子峰的精确峰位，并作曲线拟合处理求出各子峰面积，找出结构与谱带的对应关系。
蛋白质红外光谱的酰氨I带（1600～1700cm－1）经去卷积谱和曲线拟合，处理后的谱峰指认目前已相对比较成熟，其中1650～1658 cm－1为α－螺旋；1640～1610 cm－1为β－折叠；1700～1660 cm－1为β－转角；1650～1640 cm－1为无规卷曲结构[7]。乳鼠心肌细胞红外光谱中蛋白质酰胺Ⅰ谱带的曲线拟合分析见图2、图3。辐照后心肌细胞膜蛋白二级结构的变化见表1。
图2对照组乳鼠心肌细胞的红外光谱 图3照射组乳鼠心肌细胞的红外光谱
酰胺Ⅰ谱带的去卷积谱及其曲线拟合谱 酰胺Ⅰ谱带的去卷积谱及其曲线拟合谱
表1 不同剂量HPPM辐照后心肌细胞膜蛋
白二级结构含量的变化(%)
由表1看出：照射组乳鼠心肌细胞与对照组乳鼠心肌细胞相比，蛋白的α—螺旋结构平均减少了16%，β—折叠结构减少了32%，无规卷曲结构和转角结构分别增加了77%和210%，其中，1647 cm－1位置的β—折叠片的吸收峰消失而在1683 cm－1位置出现一个转角结构的弱峰。
3 讨论
蛋白质的二级结构是与其分子内形成的不同氢键类型密切相关的，傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术是研究氢键的强有力手段[8,9]。照射后乳鼠心肌细胞的红外光谱在1534 cm－1的酰胺Ⅱ谱带和1312 cm－1处的酰胺Ⅲ谱带都明显比原来的吸收增高，说明υC-N和δNH的偶合呈缔合态，同样表明了蛋白质分子间很强氢键的形成，使蛋白质发生变性和不可逆聚合。这一变化也导致了蛋白质侧链基团暴露，使1389 cm-1处吸收增强[10]。
实验结果表明：大鼠乳鼠原代培养心肌细胞受高功率微波辐照后，细胞膜结构发生了明显的改变。细胞中蛋白的α—螺旋和β—结构减少，蛋白的无规卷曲和转角结构增加。细胞膜中磷脂的构象发生了改变，碳氢链间相互作用增强，膜脂的流动性下降。
HPM可造成心肌细胞的损伤和凋亡，已从病理组织学变化和免疫组化结果得到证实[11]。用傅里叶变换红外光谱分析技术研究细胞结构的变化，是一种不受细胞状态和细胞种类限制的快速分析方法，可从分子水平上了解细胞内蛋白质的结构与功能的关系。
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