酵母表达服务技术流程

酵母表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因构建到表达载体上，并转化至酵母细胞中进行稳定表达，从而获得大量目的蛋白的方法。通过查阅相关文献资料，本文汇总了酵母表达实验过程中常见的问题，分析了可能存在的原因以及解决办法。

1、问：用毕式酵母表达蛋白，小量表达并做SDS-PAGE有一条类似三聚体的条带。大量表达时在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带？

答：在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：

（1）上样时没有目的蛋白，可能是蛋白没表达或亲和层析时没洗脱或是穿透了;

（2）目的蛋白结合在FPLC柱子上没被洗脱;

（3）目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰;

（4）电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.

2、问：用G418筛转化有多拷贝的细胞株,筛了两次,四个梯度0.5 mg/ml,1 mg/ml,2 mg/ml,4 mg/ml.结果都没长出细胞，空载体对照也没长出。载体是pPIC9K。用电转涂于MD固体培养基，发现转化效率较低，每块板长出十几个点，是否是转化效率低导致的?

答：可以从以下几点入手：

（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5 ml YPD培养基的50 ml三角瓶中，30℃、250~300 r/min培养过夜;取100-500 μl的培养物接种至含有500 ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300 r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5。

（2）电击后马上加入1ml冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体混匀。

（3）推荐：电压1.5 kV;电容25 μF;电阻200 Ω。电击时间为4~10 msec。

3、感受态制备关键点：

甘油的质量，水的质量，最好是超纯的，如果要求完美，洗瓶不要有洗涤剂残留，先将瓶装满超纯水高压，再弃去，再配置10%甘油。收菌以半对数期合适，一般OD0.5收菌，过则不佳，直接取-80℃菌种摇，次日转种，从盘上菌落摇的要差，33-34℃摇菌结果更理想。

在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗涤时一定低温，重悬时应轻震荡，弃洗涤液应倒干静，那怕损掉部分细菌。最后大概500 ml能做3-4 ml感受态，液氮中冻10 min转-80℃冰箱，也可不冷冻，直接用来转化。

感受态应以标准浓度质粒电转记算效率，一般大于10 ⁹/mg，操做以1 ng/ul质粒1 ul加40 ul感受态置0.1杯，电转后以最快的速度加入1 ml soc复活，100-150转摇1h，取1/1000铺盘应大于1000个菌生长。这样用于建库工作才行。

电转时质粒或连接物尽可能少，以减少离子，实际上离子高，电流直接通过，没有场强，质粒是进不去的。

总结：

（1）任和有关东西都要干净，保证没有离子。

（2）从接触甘油开始就保持恒0℃。

（3）电击后复活要快。

4、问：转化了一个基因到毕赤酵母，蛋白有表达，但pcr无论如何也检测不到阳性的特性条带，该如何改进？

答：提取酵母DNA当模板时，不能按操作手册说明的模板的用量进行PCR，而应该降低模板的用量，一般在ng水平已足够。譬如，挑取单菌落于3 mL适宜培养液中，摇菌过夜，用试剂盒提取酵母DNA，取1uL提取产物作为模板进行PCR鉴定已足够。

参考步骤

（1）直接用枪尖或者牙签取单克隆到10 ul无菌去离子水中;

（2）加5 ul 5 u /ul的溶细胞酶(SIGMA);

（3）37℃孵育30分钟;

（4）-70℃15分钟;

（5）煮沸5分钟;

（6）12000 rmp离心5分钟;

（7）取上清5 ul到50 ul PCR反应体系。

5、问：表达3KD左右的抗菌肽，电泳没有目的蛋白，表达小肽有哪些注意的方面?

答：首先确定蛋白是不是没有分泌，看看菌体蛋白中有没有，如果没有的话：

第一、构建多种分泌表达载体，看看各种表达载体因素如载体整合方式，整合拷贝数，5'非翻译区及甲醇利用表型对表达量的影响。

第二、一般来说发酵灌较摇瓶培养表达量更高（10-20倍）。

第三、选用酵母偏爱密码子。

第四、选用蛋白酶缺陷型得宿主菌如SMD1168等。

6、问：用毕赤酵母表达蛋白（非表达分泌型），经常会遇到表达量挺高的，但破完细胞后发现目的蛋白都在沉淀中没法往下纯化，请问这是为什么?

答：表达量高的话,表达的蛋白很容易出现不正确的折叠而形成不溶性的产物，因此要提高可溶性蛋白的表达量，最好不要让目的基因过量表达。可采取一些诸如降低温度等的措施。

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