细胞培养室的建立

 前段时间，经历了几个月的时间，为实验室建了一个细胞培养间。目前这个细胞培养间运转良好，培养的神经元长了10来天，长势不错，已经可以认为细胞培养室建立成功。在建立细胞培养间的过程中，碰到了许多问题，逐一解决后，觉得大家如果要建立细胞培养间，肯定也会碰到许多相同的问题，所以将我碰到的问题整理出来。首先向大家推荐一本书，个人认为是比较经典的——《动物细胞培养-基本技术指南》科学出版社，英，R.I.弗雷谢尼。内容不多，但以下的资料大部分是书上找不到的。   

2005-4-30  陆新江

一、建细胞间的一些细节问题： 

1、甲醛薰蒸：

资料（internet）：

40％甲醛溶液(药用规格、福建三明化工总厂出品)，用量30 ml／m3，室内温度21～24℃，相对湿度75％～85％，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗1 h。

甲醛水溶液为无色，具有强烈刺激性气味的液体，可杀灭多数微生物，价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。其主要用法为：
    1．熏蒸消毒:　对室内消毒其用量为20－25%毫升/米，在加热该溶液时最好同时煮沸一壶水，使室内相对温度保持在70-90%左右，室内温度最好在20摄氏度以上，作用时间12-24小时。如消毒皮毛服装，甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,挂衣密度为每平方米3套为宜。熏蒸消毒时应密闭门窗。消毒后一般多用自然通风驱散甲醛气体，其需时较长，急于排出气体，可将25%氨水加热蒸发中和。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，中和时间为30分钟。
    2．自然挥发: 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中，室内温度保持在18摄氏度以上，同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上，经16小时可达到室内消毒的目的。

关于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比较：甲酸的毒性比甲醇大6倍，甲醛的毒性比甲醇大30倍。所以吃进4~10克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表现在损伤视力，使视力减退（不能矫正），视野缩小，以致双目失明，直到死亡。

 实际操作：

我的每个房间是7个平方，约20个立方。按书上的算要福尔马林300ml，高锰酸钾100g。

高锰酸钾放入甲醛液体中后，在开始的3秒钟内没有反映，3秒钟以后，会产生大量烟气。所以一旦在甲醛中加了高锰酸钾请马上离开灭菌室，并关上门。

高锰酸钾放入甲醛液体中会使液体沸腾，所以反应要在比较大的大口径容器进行，本人用的是脸盆。

甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定要带上防毒面具。

2、关于紫外线：

资料：

紫外线的穿透能力非常弱的，主要靠电离产生氧自由基来消毒。细胞培养室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料盖住。如：玻璃和有机玻璃都可以的。紫外有些人认为大型精密的显微镜是不可以照紫外的，因为它们的镜头上涂的膜会被分解掉，但我特意问了我校光学系的老师，他们认为是没有关系的。

紫外线在许多实验室被认为是起心理安慰作用的。我参观过的一个细胞培养间他们的房间大约6平方米，但是只装了30W的紫外灯，但前提是他们有一个层流系统。

个人认为，如果细胞培养间有层流系统，那紫外的作用是可以被忽略的，但如果没有层流系统，那么紫外的作用还是相当重要。

此外，不要担心紫外不能照射到的角落，因为紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。

臭氧过量吸入的作用应该和双氧水的作用是一样的，个人认为也许有一定的致癌性。所以紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。 

3、关于新洁尔灭： 

资料：

【药品名称】苯扎溴铵溶液 (新洁而灭溶液) (乙类非处方药【别   名】BenzalkoniumBromideSolution【标准来源】《中华人民共和国药典》2000年版。【性   状】   无色或淡黄色的澄明液体;芳香;味极苦;强力振摇能发生多量泡沫，遇低温可能发生浑浊或沉淀。【药物组成】每毫升含苯扎溴铵0.05克 (5%)。【作用类别】皮肤科用药品。【药理作用】苯扎溴铵为阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂。【临床应用】用于皮肤黏膜和伤口的消毒。【用法用量】   外用，使用前应稀释即配即用。皮肤消毒使用0.1%溶液；创面黏膜消毒用0.01%溶液； 稀释方法：0.1%溶液：取本品一份，加纯化水或清水50份；0.01%溶液：取本品1份，加纯化水或清水500份。【注意事项】   l. 本品为外用消毒防腐药，不可内服。2. 不得用塑料或铝制容器贮存。3. 涂布部位如有灼烧感、瘙痒、红肿等，应停止用药，洗净。必要时向医师咨询。4. 低温时，可能出现混浊或沉淀，可置于温水中加温，振摇使溶解后使用。5. 儿童必须在成人监护下使用。【不良反应】偶见过敏反应。 【药物相互作用】   l. 不得与肥皂或其他合成洗涤剂并用。2. 局部消毒时勿与碘酊、高锰酸钾、双氧水、磺胺粉等并用。 3. 如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。【规   格】500毫升﹕25克；100毫升﹕5克(5%)。【贮   藏】避光，密封保存。

评论：在甲醛灭菌前，先用新洁尔来擦洗整个墙面，此外，平时地板灭菌也可以用它。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。

 二、培养准备时的一些问题： 

1、多聚赖氨酸：

 资料：多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） 　

Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, 0.01%, added as preservative

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

[使用说明]
免疫学
操作步骤（可直接在玻片上涂布）
1． 灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
2． 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃
3． 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

[注意]
1． 每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。
2． 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。
3． 不要在用过的稀释液中加新的溶液。
4． 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。
5． 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

 2、洗液的一些问题：

 资料：

重铬酸钾硫酸洗液
　　通常称为洗洁液或洗液，其成分主要为重铬酸钾与硫酸,是强氧化剂。
　　K2Cr2O7+4H2SO4        K2SO4+Cr2(SO4)3+3[O]+
　　因其有很强的氧化力，一般有机物如血、尿、油脂等类污遗迹可被氧化而除净。事先将溶液稍微加热，则效力更强。新鲜铬酸洗液为棕红色，若使用的次数过多，重铬酸钾就被还原为绿色的铬酸盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重铬酸钾，仍可继续使用。
　　配方：稀洗液        重铬酸钾        10g
                                粗浓硫酸        200ml
                                水              100ml
　　　　　浓洗液        重铬酸钾        20g
                                粗浓硫酸        350ml
                                水              40ml
　　配法：先取粗制重铬酸钾20g，放于大烧杯内，加普通水100ml使重铬酸钾溶解（必要时可加热溶解）。再将粗制浓硫酸（200ml）缓缓沿边缘加入上述重铬酸钾溶液中即成。加浓硫酸时须用玻璃棒不断搅拌，并注意防止液体外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶内面必须没有掉瓷，以免强酸烧坏瓷桶。配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。
　　使用时先将玻皿用肥皂水洗刷1～2次,再用清水冲净倒干,然后放入洗液中浸泡约2小时,有时还需加热,提高清洁效率。经洗液浸泡的玻皿，可先用自来水冲洗多次，然后再用蒸馏水冲洗1～2次即可。
　　附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可对有如酒精、乙醚的容器用洗液洗涤。
　　洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应妥善保存。使用时带保护手套。为防止吸收空气中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。 

注意：

洗液具有强烈的腐蚀性，接触皮肤后会，皮肤会变黄，2天后会脱一层皮。

 3、氟尿嘧啶：

别   名：5氟尿嘧啶  英 文 名：Fluorouracil (5 FU)。作用与用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。

 操作：在神经元培养时可以用来抑制胶质的生长。

 4、L-谷氨酰氨：

 资料：

氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨
基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨
酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡.
因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应
置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储
存2周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺.

 三、海马神经元培养的方法：

 操作步骤：

1．取 2ml  左右的L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml） 包被培养板或coverlip；

2. 将出生小于24h的乳鼠6-8个用70%乙醇消毒，逐个断头，取脑，放入冰浴的解剖液中；

3.      用弯头镊镊取海马和皮层，去除脑膜和血管，分别放入干净的平皿中，用手术刀片分别将海马和皮层切细。

4.      将组织块置于15ml解剖液配制的0.25%胰蛋白酶中，37ºC，静置20min，取出时，勿摇晃。

5.      吸弃去上层胰酶液，下层组织沉淀约2ml, 加3ml种植液冲洗一遍。静置约3分钟。

6.      吸弃去上层液体，下层组织沉淀约2ml, 加3ml种植液冲洗一遍。离心800rpm×1min

7.      吸弃去上层液体，加2ml种植液

8.      用一根吸管，头烧细，冷却，轻轻吹打约15-20次，制成细胞悬液。

9.      取50ul细胞悬液稀释到1ml, 计数4大格。

10.  细胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/ml

11.  例如120/4×20×104/ml=6×106/ml

12.  按照0.6--2×106/ml的密度接种神经元。

13.  24h后全量换液成饲养液

14.  每三天用Neuronbasal使用液半量换液。

15.  接种后3-5天，加阿糖胞苷至终浓度10uM作用48小时，抑制胶质细胞的过度生长。

 注意事项

1 用L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml） 包被培养板后，要待其干后才能接种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。

2 取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。

3 分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤维细胞。

4 用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。

5 接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。

6 接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。

四 结果：

大多数神经元在接种1h内贴壁，3-5h开始变平，并长出1-2个突起。3天后，许多细胞从胞体长出数个突起。神经元在7-10天开始成熟，胞体逐渐长至30-40um,晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗，变长并且有分支，边缘清楚，发亮，形成明显的神经网络。神经元可存活1-2月。