PNAS | 小鼠PARL缺乏导致线粒体内膜复合物III缺陷、辅酶Q耗竭和Leigh样综合征

PARL蛋白酶是菱形家族中wei一已知的线粒体蛋白酶成员。菱形蛋白酶是一种线粒体膜内切割蛋白酶和假蛋白酶，涉及多种功能。菱形蛋白酶常与人类流行疾病（包括癌症和神经退行性疾病）具有一定的病理相关性，菱形蛋白酶在维持线粒体结构和功能方面具有重要的生理作用。当 PARL 蛋白酶被消融时线粒体会严重受损，可导致神经Leigh 样变性，类似于人类线粒体疾病Leigh综合征。这种显著的神经变性与细胞凋亡的改变无关，而是与大量坏死有关，这引发了潜在机制性的问题。

鲁汶大学VIB（脑与疾病）研究所与伦敦大学IKU研究所对PARL缺陷型小鼠的脑部线粒体进行呼吸代谢与线粒体膜电位、ROS、钙离子等方面进行检测，该文章“PARL deficiency in mouse causes Complex III defects,coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome”于2019年发表 《PNAS》 杂志上，文章中假设Parl-/- Leigh氏综合征是由线粒体内膜 CIII 和 CoQ 缺陷的组合决定呼吸链功能障碍从而导致的。然而，也不能排除由 PARL 缺乏引起的其他线粒体功能和结构缺陷，也可能引发神经变性的发病机制。

该文中使用O2k对模型鼠脑部线粒体、神经突触细胞进行了耗氧率、线粒体膜电位、ROS和钙离子浓度进行了分析，分析结果如下：

一、Parl - / -脑线粒体中的 CIII 和 CoQ 缺陷。使用O2k高分辨率呼吸代谢检测系统对脑神经元线粒体进行检测。蓝色曲线表示氧气浓度，红色曲线表示其耗氧率。纯化的突触体(50 µg) 装入 Mir06 缓冲液中。滴定洋地黄皂苷 (Digi) 以实现z佳突触体通透化。底物如下：CI（PMG，丙酮酸+苹果酸+谷氨酸），CII（Succ，琥珀酸）和CIV（ASC/TMPD，抗坏血酸+TMPD）。解耦联剂是 CCCP。抑制剂如下：CI（ROT，鱼藤酮）、CIII（Aa，Antimycin a）和 CIV（KCN，氰化钾）。呼吸状态用红色虚线表示。CI LEAK，CI 驱动的质子漏呼吸；CI OXPHOS，CI 驱动的磷酸化呼吸；CI+II OXPHOS，由 CI 和 II 的联合激活驱动的磷酸化呼吸；CI+II ET，由CI和II组合驱动的电子转移能力；CII ET，由CII驱动的ET；CIV，CIV 驱动的呼吸；Cytc，外源性细胞色素添加c以评估线粒体外膜的完整性。在过氧化氢酶存在下使用H2O2为腔室重新充氧。

二、使用O2k荧光检测模块，同时对 PARL 缺乏是否会损害脑线粒体中其他重要的线粒体功能进行评估。包括：线粒体钙保留能力、线粒体膜电位、ROS的生成能力

使用O2k荧光模块以及Calcium Green 5N试剂对纯化的脑线粒体进行钙保留能力测试，发现Parl-/-的钙保留量明显降低

使用O2k荧光模块及safranin O试剂对脑线粒体中的线粒体膜电位（即Δψ）进行检测，明显可见Parl-/-脑线粒体膜电位降低

使用O2k荧光模块及Amplex UltraRed试剂对线粒体产生的ROS进行检测，除了使用 CI 底物略有增加外，所有实验条件下的 ROS 产生都相似

结果表明：PARL缺乏是对大脑氧化应激的主要影响，但我们发现对线粒体钙代谢同样也产生了严重影响。线粒体钙是细胞死亡（包括坏死）的关键决定性因素，在许多神经退行性疾病中尤为重要，包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病以及由另一种线粒体蛋白酶AFG3L2突变引起的遗传性神经系统疾病。

参考文献：Spinazzi M, Radaelli E, Horré K, Arranz AM, Gounko NV, Agostinis P, Maia TM, Impens F, Morais VA, Lopez-Lluch G, Serneels L, Navas P, De Strooper B (2019) PARL deficiency in mouse causes Complex III defects, coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 116:277-86.