葡萄糖和 ATP测定丨Worthington葡萄糖-6-磷酸脱氢酶方案

葡萄糖和 ATP测定丨Worthington葡萄糖-6-磷酸脱氢酶方案

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PD) 是一种调节酶，催化戊糖磷酸途径的第一步：使用 NADP +和/或 NAD +氧化葡萄糖-6-磷酸。

L. mesenteroides 的 G6PD 因其独特的双辅酶特异性而得到了非常详细的研究。大多数脱氢酶更喜欢 NAD +或 NADP +，但 L. mesenteroides G6PD 都可以使用。

艾美捷Worthington葡萄糖-6-磷酸脱氢酶特异性：

NAD 或 NADP 都可以作为辅酶，NAD 的内在反应速度大约是 NADP 的 1.8 倍（Olive 和 Levy 1967）。D-葡萄糖-6-磷酸被认为是天然底物，尽管 D-葡萄糖反应缓慢 (Metzger et al . 1972)。

Asp177 和 His240 形成 G6PD 的催化二元组。His240 作为从 6-磷酸葡萄糖中提取 C-1 质子的碱基；Asp177 稳定产生的正电荷 (Cosgrove et al . 1998)。

作品：

L.mesenteroides G6PD 是相同亚基的二聚体，每个二聚体有两个活性位点，假定位于辅酶结合位点和每个亚基中的大 β+α 结构域之间的口袋中（Rowland等， 1994）。这个口袋包含几个完全保守的氨基酸，包括一个八残基肽（Cosgrove et al . 1998）。

分子特征：

L. mesenteroides G6PD 基因编码 485 个氨基酸的多肽。G6PD 的独特之处在于它不含半胱氨酸残基。已经确定了在生理条件下仅使用NADP +的人和大肠杆菌的序列。Z. mobili的序列与L. mesenteroides一样可以使用 NADP +或 NAD +，也已确定。这些物种中的任何两个之间大约有 30-36% 的序列同一性。一个保守的序列从 Arg175 开始，并含有一个赖氨酸残基，被认为在葡萄糖-6-磷酸结合中起作用 (Lee et al . 1991)。

艾美捷Worthington葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的特性：

分子量：440,000 (Lee and Harpst 1973; 另见 Main et al . 1974)

组成：Lee 和 Harpst (1973) 指出 ButChE 是一种四聚体结构，具有相同大小的 110,000 道尔顿的亚基。它是一种糖蛋白。主要等人。(1974) 已经确定了氨基酸和碳水化合物的组成，基于 101,000 的颗粒重量。另见 Chiu等人。（1972 年）和帕夫利奇（1972 年）。

最佳 pH 值：6.0-8.0 (Augustinsson 1960)

消光系数：E 280 =13.6 (Main et al . 1974)

活化剂：Ca 2+和 Mg 2+ (Augustinsson 1960)

艾美捷Worthington葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的应用：

1.测量 NADPH 或 NADH 的系统（Bhattacharya 和 Ali 1988）

2.葡萄糖和 ATP（与 HK 偶联时）、果糖、6-磷酸葡萄糖、NAD(P) +和 CK的测定

相关文献：

1.Anderson, W. 和 Nordlie, R.： 酵母葡萄糖 6-脱氢酶的葡萄糖脱氢酶活性。I. 碳酸氢盐、磷酸盐和硫酸盐的选择性刺激 , Biochemistry 7 , 1479, 1968

2.Balaguer, P.、Terouanne, B.、Eliaou, J.、Humbert, M.、Boussioux, A. 和 Nicolas, J.： 使用葡萄糖 6-磷酸脱氢酶作为核酸杂交反应的新标记 ， 肛门生化 180 , 50, 1989

3.Ben-Bassat, A. 和 Goldberg, I.： 来自甲醇生长的假单胞菌 c.的葡萄糖 6-磷酸脱氢酶 (NADP + /NAD + ) 和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (NADP +/ NAD + ) 的纯化和性质。 , Biochim Biophys Acta 611 , 1, 1980

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

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Worthington对肝细胞分离系统的测试及相关优化方案

肝细胞分离系统：

已发表的用于分离肝细胞的大多数传统方法使用粗制和部分纯化的酶制剂，包括各种类型的胶原酶和其他蛋白酶。

最近，使用具有更好特征的胶原酶制剂，例如 艾美捷 Worthington 1 型和 4 型 (CLS-1, 4) 提供了更好的结果。所有粗制胶原酶制剂都可能包含批次可变的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人员预先筛选几批酶和/或不断修改分离参数和方案。

艾美捷Worthington 肝细胞分离系统的开发旨在为研究人员提供可靠、方便和一致的肝细胞分离系统。通过使用该试剂盒中包含的预先优化的酶组合，可以最大限度地减少批次间的差异并提高分离肝细胞的质量。此外，Worthington 通过从成年大鼠中分离肝细胞对每批产品进行使用测试，以确保活细胞的性能、可靠性和一致的产量。

该方法基于 Berry, MN 所描述的方法，由 Seglen, PO 修改（细胞生物学方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 编辑，学术出版社，1976 年；第 4 章，“分离的大鼠肝细胞的制备”， pp 29-83），并与几位研究人员一起进一步优化。 

稳定性/储存：试剂在环境温度下在正常运输程序中预期的一段时间内是稳定的，但包装在到达时应冷藏。使用前，内容物可在 2-8°C 下保存 4-6 个月。储存在 2-8°C。

包装内容 该包装包含足够的材料，可用于五次单独的成年大鼠肝脏灌注。对于更大或更小的组织应用，请在每个步骤中准备相应体积的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 浓缩液，1 瓶，500ml 无菌不含钙和镁的汉克平衡盐溶液 (CMF-HBSS)。该溶液用于在加入解离酶溶液之前洗涤和灌注肝脏。

小瓶 #2：胶原酶-弹性蛋白酶小瓶，5 瓶 Worthington 胶原酶（代码：CLS-1）和弹性蛋白酶（代码：ESL），通过 0.22μm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

3 号小瓶：每个 1,000 单位 DNase I，5 瓶 Worthington DNase I（代码：D），通过 0.22 µm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 缓冲浓缩液，用于缓冲重构的 Leibovitz L-15 培养基。

 5 号小瓶：7.5% 碳酸氢钠 (NaHCO3)，1 瓶，100ml 7.5% 碳酸氢钠浓缩液，用于缓冲稀释的 CMF-HBSS。  

小袋，包含 Leibovitz L-15 培养基粉末，1 x 1L 通过切开信封顶部并将内容物倒入含有大约 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重构小袋的全部内容物。用额外的 100 毫升水冲洗袋子 2 - 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。

灌注隔离所需但不包括在内：  

• 用于动物麻醉和手术的设备和工具

• 带有气泡捕集器的灌注装置，适用于10-30ml/min、37°C 的肝脏灌注。插入门静脉的管子是薄壁的，内径为 0.35-0.45mm 注意：测量灌注回路的死体积

• 适用于肝细胞沉降的低速离心机 • 用于细胞沉降、培养或孵育的实验室器具，包括无菌 150 X 25mm 培养板

• 一种计数或估计细胞产量的方法 • 一种无菌过滤溶液的方法，如果需要的话

• 细胞培养基和用品（如果需要） • 无菌细胞培养级水

• 浓缩抗生素：如果需要，用于培养的青霉素、链霉素、Fungazone 等。

• 手术线，丝绸，000 号

• 肝素（可选）

 对于细胞定量和活力评估： • 改进的 Neubauer 血细胞计数器 • 计数器 • 巴斯德移液器或微量移液器 • 显微镜 (10X)，最好是倒置相差 • 标准 10ml 血清移液器

注意：以下程序假定以前在肝脏消化和细胞分离方面的经验。对于那些没有经验的人，请参阅上面提到的 Seglen 的出版物或 Alpini 等人的出版物。题为“Recent Advances in the Isolation of Liver Cells”的文章发表于 Hepatology (1994) 20:494-514。Berry, MN, Edwards, AM 和 Barritt, GJ；RH Burdon 和 PH Van Knippenberg, eds., Elsevier, Amsterdam,纽约，牛津，第 2 章，（1991 年）。  

一、1肝消化的初步步骤  

以下协议中指定的体积适用于大约 80-100ml 的灌注体积。对于不同的灌注系统，可能需要进行比例调整。

注意：应使用无菌技术、玻璃器皿和塑料器皿。还建议使用无菌罩以避免培养物污染。  

准备：  

1 号瓶，10X CMF-HBSS：用 850 毫升无菌水稀释 100 毫升 10X CMF-HBSS，并在 1 升无菌瓶中加入 4.7 毫升 7.5% 碳酸氢钠（5 号瓶，NaHCO3）。如有必要，将 pH 值调节至 7.4。用无菌水使 (QS) 的总体积达到 1L。如果没有无菌水，混合成分和无菌 (0.22u) 过滤器。总共5L。  

• Leibovitz L-15 培养基，1 x 1L：通过切开信封顶部并将内容物倒入装有 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重新配制袋中的全部内容物。用额外的 100 毫升水冲洗袋子 2 - 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。  

 • 酶缓冲液：将 13.3ml MOPS 浓缩液与 10ml 无菌水和 76.7ml L-15 混合在一个 100ml 无菌瓶中。将足够的 L-15/MOPS 转移到每个小瓶 #2 和一个小瓶 #3 中以溶解内容物，轻轻混合以完全溶解并将酶转移回 100 毫升瓶中。胶原酶、弹性蛋白酶和 DNase 的浓度分别约为 225U/ml、0.3U/ml 和 10U/ml。  

• 用CMF-HBSS 冲洗无菌灌注装置，排除系统中的所有空气，除气泡阱中的空气。  

• 将 150 x 25mm 或同等大小的培养皿放在灌注装置附近以接收灌注的肝脏。

二、成年大鼠肝脏的灌注和消化  

以下步骤应在层流罩或安全柜中执行。特别是，消化的肝脏应在无菌条件下进行处理，除非急性孵育会终止程序。

1. 用肝素对大鼠进行预处理是有帮助的。灌注前约 20 分钟腹腔注射，或在打开腹部后注入静脉（Seglen 建议使用髂腰静脉）。使用范围为 100-200U/100g 体重。  

2. 麻醉一只体重 200-400g 的大鼠，并将其定位以进行解剖。在大鼠下安装足够的衬垫以保持血液和初始灌注液。将老鼠放在它的背上, 用胶带把腿贴下来, 用碘溶液或 70% 乙醇对腹部进行消毒, 然后打开腹部露出肝脏。将肠子移到腹部的左侧（当你向下看时，老鼠的头远离你，向右移动）暴露肝门静脉。  

3. 使用一对细的弯曲镊子，将一段 000 手术线放置在门静脉下方和门静脉周围，就在门静脉和靠近肝脏的最终肠系膜静脉的交叉点上方（朝向头部）。在静脉周围打一个松散的半方形或等效结。找到腔静脉，以便在门静脉 (vena porta) 被插管之前打开以进行引流。   

4. 以 10-15ml/min 的流速打开含有普通 CMF-HBSS 的灌注泵，以便将管子或套管插入门静脉。调节浴温以使灌注液温度为 37°C。在右肾附近的腔静脉切一个切口以降低血压，然后用细手术剪在门静脉（部分穿过）在打结的线下方（朝向尾部）约 5 毫米处切一个切口。将管子插入门静脉，朝向肝脏，距松结仅几毫米。肝脏应该没有血液。将手术线紧紧地系在门静脉和管道周围。切开腔静脉并将灌注液流速增加到 20-25ml/min。笔记：

5. 小心地从动物身上取出肝脏；不着急。将肝脏放在网状舞台上，使其可以以循环方式灌注。然而，最初的 CMF-HBSS 灌注液被浪费了。  

6. CMF-HBSS 灌注 7-10 分钟后，转用酶缓冲液（含有酶的 L-15 消化培养基）进行灌注。在剩余 CMF-HBSS 的一个系统死体积被浪费后开始再循环。  

7. 用消化混合物灌注肝脏，直到它完全膨胀（但不会过早）并且肝脏被完全消化，大约需要 20-30 分钟。注意：如果门静脉破裂或肝脏表面在用镊子或钝物接触时出现崩解迹象，请立即停止灌注并取出肝脏。

8. 灌注结束，停止泵，轻轻将肝脏置于 150ml 或等量的培养皿中，取出灌注管。如果尚未将培养皿转移到无菌罩中，则向培养皿中加入大约 150ml 新鲜的 CMF-HBSS。   

9. 在培养皿中，用镊子或狗梳（Seglen 推荐）轻轻撕下小叶囊膜，并耙出细胞。去除结缔组织和血管组织的大中央树，以及任何未消化的组织或结缔组织。  

10. 轻轻搅拌培养皿以分散细胞。通过将一侧支撑在盖子上，将盘子倾斜放置。让团块或结缔组织静置一分钟左右，然后在板的最深处，即靠近下边缘，从缓冲液顶部取出分散的细胞，并将细胞悬液转移到 50ml 无菌管中。  

11. 在室温下低速离心 3 分钟（对于松散的细胞团块来说足够快，例如 100 xg）。  

12. 向培养皿中加入更多的 CMF-HBSS，重复该过程以增加细胞产量。只要可以去除干净的细胞，就重复。

13. 细胞沉淀后，立即加入新鲜的 CMF-HBSS，倒置加盖的试管以悬浮细胞，并按上述方法重新离心。再次重复该过程以从细胞中去除消化酶的痕迹。弃去上清液，将细胞转移到培养基或第二个 100mm 或 150mm 培养皿中的缓冲培养基中。在离心机中温和沉降后，良好消化 300 克大鼠肝脏的细胞产量约为 4-5 毫升填充体积。  

肝细胞培养（可选）

尽管特定于应用，但肝细胞已在多种培养基中培养，包括 DMEM、Leibovitz's L15、改良 Chee's 培养基、Williams E 培养基、RPMI 和 Waymouth's MB 752/1。一般来说，媒体都补充了许多因素，以保持差异化状态。其中包括 EGF、胰岛素、胰高血糖素、地塞米松、亚硒酸盐、烟酰胺和肝细胞生长因子（Chen 等，1998）。肝细胞专用培养基可从其他供应商处购买。为了成功地培养肝细胞，培养器皿通常涂有基质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白或某种类型的商业基质。

肝细胞培养的进展包括使用胶原蛋白或 MatrigelTM 的三维基质（凝胶）。陈等人。(1998) 将肝细胞铺在 MatrigelTM (TMBecton Dickinson, Bedford MA) 上，几周后取出细胞并将它们重新铺在胶原凝胶上。24小时后，加入第二层胶原凝胶。或者，可以将细胞直接铺板在胶原凝胶中并保持为三维培养物。

一篇综述讨论了培养变量对人类肝细胞的影响（Le Cluyse，2001），并且可能适用于其他物种的肝细胞培养。同一作者回顾了大鼠肝细胞培养的最佳条件（Le Cluyse 等，1996）。

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Worthington：来自酵母的己糖激酶的特性及其它参数说明

艾美捷Worthington己糖激酶酶促反应：

己糖激酶以两种不同的形式从酵母细胞中分离出来，称为 PI 和 P-II (Schulze et al . 1969)。这些是独立的、不可相互转化的同工酶（Womack等人1973）。

艾美捷Worthington来自酵母的己糖激酶的特性：

分子量：天然形式的分子量约为 100,000 (Schulze et al . 1969)，由分子量略高于 50,000 (Schmidt et al . 1973) 的多肽链组成。

最佳 pH 值：7.5 - 9.0 (Sols et al . 1958)。

组成： PI 和 P-II 都含有相同的氨基末端缬氨酸和相同的羧基末端丙氨酸。Schmidt等人已经报道了氨基酸组成。（1973b）。

消光系数：消光系数PI 为 8.85，P-II 为 9.47（Schmidt等人1973）。

等电点：PI, 5.25 和 P-II, 4.93 (Schmidt et al . 1973)。

抑制剂：酶被与 SH 基团反应的化合物抑制。它还被 1-磷酸山梨糖、多磷酸盐、6-脱氧-6-氟葡萄糖、2-C-羟基-甲基葡萄糖、木糖和来苏糖抑制（Sols 等人 1958 和 McDonald 1955）。

活化剂：己糖激酶的催化活性需要镁离子。它被儿茶酚胺和相关化合物激活 (Harrison et al . 1972)。钙离子不影响酶活性。

特异性：该酶磷酸化 D-果糖、5-酮基-D-果糖（Avigrad等人1968）、D-葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖、D-甘露糖和 D-葡糖胺。已证明 ATP 和 ITP 在酵母己糖激酶反应中发生转磷酸化 (Martinez 1961)。PI 与果糖的活性是葡萄糖的 2.6 倍，而 P-II 的果糖:葡萄糖比为 1:3 (Lazarus et al . 1966)。Bessell等人已经广泛研究了酵母己糖激酶的底物特异性。（1972）。

稳定性：冻干制剂和结晶悬浮液在 2-8°C 下可稳定 6-12 个月。

艾美捷Worthington己糖激酶测定：

Method : 该测定基于通过与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的偶联反应 减少NAD + ，并通过测量340 nm处吸光度的增加以分光光度法测定。

在指定条件下，在 30°C 和 pH 8.0 条件下，一个活性单位每分钟可减少 1 微摩尔 NAD + 。

试剂：

1.0.05 M Tris*HCl 缓冲液，pH 8.0，含 13.3 mM MgCl 2

2.0.67 M 葡萄糖在上述 Tris⋅MgCl 2缓冲液中

3.16.5 mM 腺苷 5'三磷酸在上述 Tris⋅MgCl 2缓冲液中

4.6.8 mM NAD 在上述 Tris⋅MgCl 2缓冲液中

注意：NAD 的盐形式和水合程度可能会有所不同。应小心使用分析级和正确的分子量。

肠系膜明串珠菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Worthington 代码：ZF 或 ZFL）。以 300 IU/ml 的浓度溶解在上述 Tris⋅MgCl 2缓冲液中。使用期间储存于 0 - 4°C。

酶：

溶解在 Tris⋅MgCl 2缓冲液中，pH 8.0 以获得 0.02 - 0.04 ΔA/min 的速率。

程序：

将分光光度计调整到 340 nm 和 30°C。

将移液器移入每个比色皿，如下所示：

Tris⋅MgCl2 缓冲液 2.28 毫升

0.67 M 葡萄糖 0.50 毫升

16.5 毫米三磷酸腺苷 0.10 毫升

6.8 毫米 NAD 0.10 毫升

G-6-PDH 0.01 毫升

在分光光度计中 30°C 孵育 6-8 分钟以达到温度平衡并建立空白率（如果有）。在零时，加入 0.1 ml 稀释的己糖激酶溶液并彻底混合。记录 A 340增加3-4 分钟。从曲线的初始线性部分确定 ΔA/min。

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组蛋白研究丨Worthington小牛胸腺组蛋白的特征及文献参考

组蛋白是一组与染色体中的 DNA 相关的水溶性和稀酸可溶性碱性蛋白。它们的特点是赖氨酸和精氨酸含量相对较高。尽管组蛋白被分类为有限数量的级分类型（见下文），每个特定级分具有基本不同的氨基酸组成和序列，但由于各种氨基酸残基的乙酰化、甲基化和磷酸化，观察到许多亚级分。结构的微异质性或改变是动态的，因此发现单个细胞类型的组蛋白在发育过程中会发生变化。它们被认为在基因活动和细胞代谢中发挥作用。参见“染色质的结构和功能”，汽巴基金会研讨会 28，美国爱思唯尔，纽约（1975 年）。

尽管组蛋白的经典命名法是 Johns 和 Butler (1962) 的命名法，但 Bradbury (1975) 的命名法已提交给 IUPAC。

艾美捷Worthington小牛胸腺组蛋白的特征：

来自埃尔金和温特劳布（1975）

  分数（命名法）  

班级 布拉德伯里 约翰斯 分子量

富含赖氨酸 H1 f1 约 21,500

略富含赖氨酸 H2a f2a2 14,004

略富含赖氨酸 H2b f2b 13,774

富含精氨酸 H3 f3 15,324

富含精氨酸 H4 f2a1 11,282

除 H1 外，已确定小牛胸腺组蛋白的主要结构。与来自其他来源的组蛋白结构的比较表明，组蛋白是自然界中最高度保守（低突变率）的蛋白质之一。

经常发现天然存在的组蛋白被部分乙酰化、甲基化或磷酸化。这些修饰可能有助于组蛋白组分的电泳微异质性。

组蛋白和脱氧核糖核酸的核蛋白复合物称为核组蛋白或脱氧核糖核蛋白。它作为其两个组成部分的来源以及物理研究本身的一个实体非常重要。在细胞内，这些复合物可能是染色体结构和基因转录的重要因素。Kornberg (1974) 提出了一个染色质模型，其中 200 个 DNA 碱基对盘绕在由 (H3) 2 (H4) 2四聚体和 H2a 和 H2b 各两个组成的组蛋白单元的外侧。

Bradbury (1976) 提出 H1 可能参与产生更高级的染色质结构，并且有丝分裂的起始可能部分由 H1 磷酸化介导。

艾美捷 Worthington 组蛋白在 pH 7.0 时是水溶性的，其特征在于凝胶电泳和溶解度。在 2 - 8°C 下稳定多年。储存干燥时。

相关文献参考：

1.Adler, A.、Moran, E. 和 Fasman, G.：DNA 与组蛋白 f2a2 和 f3 的复合物。圆二色性研究 , 生物化学 14 , 4179, 1975

2.Allfrey, A. 、 Littau, V. 和 Mirsky, A.： 关于组蛋白在调节细胞核中核糖核酸合成中的作用，美国国家科学院院刊 49 , 414, 1963

3.Balekjian, A. 和 Longton, R.： 从人类腮腺液中分离的组蛋白 ， Biochem Biophys Res Commun 50 , 676, 1973

4.Balhorn, R.、Jackson, V.、Granner, D. 和 Chalkley, R.： 整个细胞周期中富含赖氨酸的组蛋白的磷酸化 ， 生物化学 14 , 2504, 1975

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Worthington羟基类固醇脱氢酶技术说明及测定方案

羟基类固醇脱氢酶催化类固醇的羟基和羧基的相互转化。 睾酮衍生的羟基类固醇脱氢酶有两种类型：3-α-羟基类固醇脱氢酶（α酶）和3-β-羟基类固醇脱氢酶（β酶）。α酶的分子量为47,000道尔顿。α 酶仅氧化 C19、C21 和 C24 系列的 3-α-羟基类固醇。它受到重金属和巯基结合剂的抑制。β酶催化C19和C21系列的3-β-羟基类固醇、C18、C19和C21系列的17-β-羟基类固醇以及某些16-β-羟基类固醇的氧化。它受重金属和还原剂的抑制。睾酮的氧化被 3,17-α-雌二醇和其他 1,3,5-雌二烯衍生物抑制。

艾美捷Worthington 提供两种制剂：一种来自常规的P. testosteroni(ATCC 11966) 培养产生 α 和 β 酶，另一种来自几乎完全产生 α 酶的突变菌株。通过使用两者，可以通过差异确定β-羟基类固醇。

艾美捷Worthington羟基类固醇脱氢酶技术说明：STDHP 和 STDH 同时包含 α 和 β 活性。然而，STDHMP 仅包含 α 活性。 

单位定义：一个单位在 25°C、pH 9.0 下每分钟减少 1 微摩尔 NAD，使用雄酮或睾酮作为底物。

艾美捷Worthington羟基类固醇脱氢酶测定：

Method : 该测定是 Marcus 和 Talalay (1956) 的测定，其中反应速度被测量为由于 NAD 的减少而在 340 nm 处吸光度的增加。一个单位在 25°C 和 pH 9.0 条件下每分钟减少 1 微摩尔 NAD，在特定条件下使用雄酮或睾酮作为底物。

试剂 :

0.03 M Tris⋅HCl 缓冲液，pH 7.2，含 0.001 M EDTA

0.166 M 焦磷酸钠缓冲液，pH 9.0

0.0043 M NAD 在试剂级水中。注意：NAD 的盐形式和水合程度可能会有所不同。应小心使用分析级和正确的分子量。

0.015% 雄酮。通过将 15 mg 雄酮溶解在 100 ml 无水甲醇中来制备。

0.015% 睾酮。通过将 15 mg 睾酮溶解在 100 ml 无水甲醇中来制备。

酶 :

将纯化的酶以 1 mg/ml 的浓度溶解在含有 0.001 M EDTA 的 0.03 M Tris⋅HCl pH 7.2 缓冲液中。还用这种缓冲液进行进一步稀释。

粗酶：从细胞中提取酶可以通过用 0.001 M EDTA 对 0.03 M Tris·HCl 缓冲液（pH 7.2）中的 50 mg/ml 细胞悬浮液进行超声处理来完成。通过离心澄清并测定上清液。

对于测定，稀释酶以获得 0.02-0.04 ΔA/min 的速率。

程序 :

将分光光度计调整到 340 nm 和 25°C。

将移液器移入每个比色皿，如下所示：

0.166 M焦磷酸钠 0.6 毫升

0.0043 M NAD 0.2 毫升

试剂级水 2.0毫升

酶 0.1 毫升

在分光光度计中孵育 3-4 分钟以达到温度平衡并建立空白率（如果有）。在零时，加入 0.01 ml 睾酮溶液。记录 A 340 3-4 分钟。从曲线的初始线性部分计算每分钟 ΔA 340 。重复，使用雄酮作为底物。

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

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Worthington哺乳动物乳酸脱氢酶研究——特点及测定方案

哺乳动物乳酸脱氢酶 (LDH) 作为五个四聚体同工酶存在，由两个不同亚基的组合组成。H亚基在心肌中占主导地位，适合丙酮酸的有氧氧化。M 亚基在骨骼肌中占主导地位，更关注无氧代谢和丙酮酸减少。

单位定义：一个单位在 25°C、pH 7.3 下每分钟氧化 1 微摩尔 NADH

请注意，哺乳动物乳酸脱氢酶 的来源已从天然兔肌肉形式变为在大肠杆菌中表达的重组体。重组酶达到或超过先前提供的天然酶的规格。

艾美捷Worthington牛心LDH的特点：

分子量：35,000/亚基（Fosmire 和 Timasheff 1972）。136,700 ± 2,100/四聚体 (Huston et al . 1972)。

组成：Vallee 和 Williams (1975) 报道了它在低 pH 条件下的亚基解离。另见 Yang 和 Schwert (1972) 以及 Gold 和 Segal (1965)。

消光系数：消光系数=14.9。

活动：参见 Borgmann等人。（1974）。

特异性：该酶对 L(+)乳酸具有特异性。Meister (1950) 报告说它可以减少几种 α-酮酸和 α,β-二酮酸，但减少丙酮酸的速度大约是十分之一。

抑制剂：LDH 相当稳定。它被碘化物灭活。对汞苯甲酸盐的抑制作用很慢。见 Schwert 和 Winer (1963)；还有安德森等人。(1974) 和 Bloxham等人。（1975 年）。

活化剂：George等人报道了许多稳定酶的有机化合物，例如二甲亚砜、乙醇和甲醇。（1969 年）。己烯雌酚及其几种衍生物也可以稳定酶（Cohen et al . 1969）。

来自兔肌肉的 LDH 的特征：

分子量：140,000。

组成：Lovell 和 Winzor (1974) 报告说，四聚体在 pH 为 5 的醋酸盐 - 氯化物缓冲液中完全解离成两个二聚体（分子量 70,000）（对牛心 LDH 没有影响的条件）。磷酸盐和吡啶核苷酸稳定四聚体的四元结构。磷酸盐具有活化作用。另见 Cho 和 Swainsgood (1973)。

活性：Stambaugh 和 Post (1966) 以及 Zewe 和 Fromm (1965) 报告了反应动力学。

艾美捷Worthington乳酸脱氢酶的测定：

Method : 反应速度由 NADH 氧化导致的 340 nm 处吸光度降低来确定。在指定条件下，在 25°C 和 pH 7.3 条件下，一个单位每分钟会氧化 1 微摩尔 NADH。

试剂:

0.2 M Tris⋅HCl，pH 7.3

6.6 mM NADH 在高于 0.2 M Tris⋅HCl 缓冲液，pH 7.3

30 mM 丙酮酸钠在 0.2 以上 Tris⋅HCl 缓冲液中，pH 7.3

酶:

以 1 mg/ml 溶解在 0.2 M Tris⋅HCl 缓冲液中。使用前稀释酶以获得 0.02-0.04 ΔA/min 的速率。在 Tris 缓冲液中并保持低温。

Worthington哺乳动物乳酸脱氢酶蛋白质浓度的测定：

程序：

将分光光度计设置为 340 nm 和 25°C。

移液器如下：

Tris⋅HCl, 0.2 M pH 7.3 2.8 毫升

6.6 毫米 NADH 0.1 毫升

30 mM 丙酮酸钠 0.1 毫升

在分光光度计中孵育 4-5 分钟以达到温度平衡并建立空白率（如果有）。

加入 0.1 ml 适当稀释的酶，并从初始线性部分记录 ΔA 340 /min。

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/brand/Worthington.shtml

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Worthington来自牛奶的乳过氧化物酶的特征及测定

牛乳酶与牛泪腺和唾液腺中形成的酶相同（Morrison等人，1965；和 Morrison 和 Allen，1963）。LPO 可能对控制细菌菌群很重要（Bjorck等人，1970；Gothefors 和 Marklund，1975；以及 Morrison 和 Allen，1966）。LPO 可用于用放射性碘标记蛋白质（Gow 和 Wardlaw 1975；Holohan等人1973；Morrison 和 Bayse 1973；Bayse等人. 1972；弗朗茨和特金顿 1972；和马卡洛尼斯 1969 年）。对于膜研究，大 LPO 分子限制了对暴露表面的标记。Poduslo 和 Braun (1975) 报告了髓鞘膜蛋白的形貌。Shin 和 Carraway (1974) 和 Phillips 和 Morrison (1971) 报告了红细胞和 Nachman等人。（1973）关于血小板膜。Haustein (1975) 研究了淋巴瘤细胞和 Huber等人的细胞表面蛋白。（1975）线粒体膜。Arntzen等人报道了叶绿体膜。（1974）。Jone and Hager (1976) 和 Hogg (1974) 比较了正常细胞和转化细胞的膜蛋白。固定化 LPO 也被证明是有趣的 (Johnson et al . 1975; Karonen et al .. 1975；和大卫 1972）。

乳过氧化物酶 (LPO) 是一种带有血红素辅基的糖蛋白，可以作为两种同工酶的混合物出现。它的分子量为 77,500 道尔顿。LPO催化碘化物的过氧化氢氧化反应如下：

2I - + H 2 O 2 + 2H + → I 2 + 2H 2 O。

碘化物直接与血红素基团反应；在加入 H 2 O 2后，络合物碘化底物。LPO受肼抑制。检测程序已从 Morrison 的程序更新为基于 ABTS ® /H 2 O 2的方法，具有更高的灵敏度和重现性。

单位定义：一个单位在 25°C、pH 6.0 下每分钟减少 1 微摩尔过氧化氢。注意：此单位定义基于一种新的测定方法。以前的方法产生了大约 2.8 倍的结果。

艾美捷 Worthington 来自牛奶的乳过氧化物酶的特征：

分子量：77,500 (Rombauts et al . 1967)。

组成：LPO 是一种糖蛋白，每个分子具有一个单一的血红素辅基（Hultquist 和 Morrison，1963）。它可能由两种同工酶组成（Rombauts等人1967；Morrison等人1957；以及 Polis 和 Schmukler，1953）。另见 Morrison 和 Hultquist (1963)。

纯度指数：A 412 /A 280 = 0.93-0.96 Allen 和 Morrison 1963）。

消光系数：消光系数= 13.9。

艾美捷 Worthington乳过氧化物酶活性：

LPO 与其他过氧化物酶一样，在 H 2 O 2存在下催化许多酚和芳香胺（连苯三酚、抗坏血酸、愈创木酚等）的氧化。参见 Morrison (1970) 第 657 页以比较各种过氧化物酶的比活性，还有 Maguire 和 Dunford (1971)。Morrison 和 Bayse (1973) 指出，碘化物直接与血红素基团反应，然后在加入 H 2 O 2时，配合物碘化底物。贝斯等人。(1972) 和 Morrison 和 Bayse (1970) 报告了碘化动力学。Chung 和 Wood (1970) 报告了硫氰酸盐的氧化，Maguire 和 Dunford (1972) 报告了碘化物的氧化。

抑制剂：LPO 被肼抑制 (Allison et al . 1973)。多尔曼等人。(1968) 报告了氰化物抑制的动力学。

艾美捷Worthington乳过氧化物酶的测定：

方法：测定程序是对 Morrison (1970) 描述的程序的轻微修改。反应速度通过测量由三碘化物产生引起的A 350的增加来确定。在指定条件下，在 25°C 和 pH 7.0 条件下，一个单位每分钟会形成 1 微摩尔三碘化物。

试剂：

0.033 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.0

磷酸盐缓冲液中的 0.005 M 碘化钾

0.090 M 过氧化氢。用试剂级水将 0.1 ml 过氧化氢（Merck Superoxol 或等效物）稀释至 10 ml。

酶：

以1 mg/ml 溶解在磷酸盐缓冲液中。临用前，在磷酸盐缓冲液中进一步稀释以获得 0.02-0.04 ΔA/分钟的速率。

程序：

将分光光度计设置为 25°C 和 350 nm。通过用 0.005 M 碘化钾将 0.15 ml 0.090 M 过氧化氢稀释至 30 ml 来制备反应混合物。在室温下储存不超过 30 分钟。将 3.0 ml 反应混合物移入比色皿中，并在 25°C 下孵育 3-4 分钟以达到温度平衡并建立空白率（如果有）。加入 0.01 ml 稀释酶并记录 A 350中 3-4 分钟的增加。从曲线的初始线性部分计算 ΔA 350 /分钟。反应保持线性不超过 1-2 分钟。

计算：

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/brand/Worthington.shtml

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Worthington溶菌酶技术说明及文献参考

溶菌酶优先水解 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1,4 糖苷键，这些键存在于某些微生物的粘肽细胞壁结构中，例如溶血微球菌（产品代码：ML）。对几丁质低聚物表现出稍微有限的活性。它的分子量为 14,388 道尔顿。最佳 pH 值为 9.2。溶菌酶受表面活性剂如十二烷基硫酸盐、酒精和脂肪酸的抑制。咪唑和吲哚衍生物形成抑制性带电转移复合物。

稳定性/储存: 在 2-8°C 下稳定 3-5 年。pH 值 4-5 的溶液在冷藏下可稳定数周，在环境温度下可稳定数天。储存在 2-8°C。

艾美捷 Worthington溶菌酶技术说明：

由于测定差异，Worthington 测定的 8,000u/mg 相当于其他方声称的 50,000u/mg。

单位定义：一个单位等于在 pH 7.0 和 25°C 下，在 450 nm 下，浊度每分钟降低 0.001，使用 0.3mg/ml溶血微球菌细胞悬液（WBC 产品代码 ML）作为底物。

艾美捷 Worthington溶菌酶测定：

Method : Micrococcus lysodeikticus的裂解率按照 Shugar (1952) 的建议进行测定。一个单位等于在指定条件下，在 pH 7.0 和 25°C 下，在 450 nm 处浊度每分钟降低 0.001。据报道，在这些条件下，纯溶菌酶制剂的活性范围很广。8,000 u/mg dw 的 Worthington 比活度相当于其他供应商声称的 50,000 u/mg dw。

试剂：

0.1 M 磷酸钾，pH 7.0

Micrococcus lysodeikticus细胞：通过将 9 mg 干燥的Micrococcus lysodeikticus（Worthington 代码：ML）细胞悬浮在 25 ml 0.1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中进行制备。用相同的缓冲液稀释至终体积为 30 ml。

酶：

将酶以 1 mg/ml 的浓度溶解在冷试剂级水中。保持凉爽直到化验。在测定前立即用试剂级水稀释至 150-500 单位/ml 的浓度。（速率应在 0.015-0.040 ΔA 450 /分钟之间）。

程序：

将分光光度计调整到 450 nm 和 25°C。

吸取 2.9 ml溶血微球菌细胞悬液到比色皿中，孵育 4-5 分钟以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。向比色皿中加入 0.1 ml 适当稀释的酶，并记录曲线初始线性部分的A 450每分钟变化。

计算：

艾美捷 Worthington溶菌酶相关参考文献：

1.溶菌酶，E。Osserman、R. Canfield 和 S. Beychak，纽约学术出版社，1974 年

2.Acharya, A. 和 Taniuchi, H.： 溶菌酶二硫化物中间体的结构和稳定性对复性机制的影响 ， Mol Cell Biochem 44 , 129, 1982

3.Acharya, A. 和 Taniuchi, H.： 溶液条件对硫醇依赖性复性过程中连续非天然二硫键的鸡蛋溶菌酶中间体形成的 影响 ， J Biol Chem 255、1905、1980

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

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Worthington纯化酶制剂助力新生儿心肌细胞分离系统研究

艾美捷 Worthington 新生儿心肌细胞分离系统的开发旨在为研究人员提供可靠、方便和一致的新生大鼠心肌细胞分离方法。通过使用纯化的而不是粗制的酶制剂，可以最大限度地减少批次间的差异。此外，Worthington 通过从新生大鼠心脏中分离心肌细胞对试剂盒进行使用测试，以确保活细胞的性能、可靠性和一致的产量。

该试剂盒是与 Ronal MacGregor 博士合作制定的。该方法基于 Toraason 等人描述的方法。Toxicol, 56 , 107 (1988)，其中将切碎的组织与纯化的胰蛋白酶在 2-8°C 下孵育过夜。正如 Toraason 所指出的，与在温胰蛋白酶或胶原酶中连续孵育所涉及的时间相比，此步骤减少了收获细胞所需的手动操作时间。使用纯化的胶原酶而不是粗胶原酶来最大化产量和活力。

艾美捷 Worthington新生儿心肌细胞分离系统内容：

该包装包含足够的材料，可用于五个单独的组织解离，每个包含多达 12 个心脏。对于较大或较小的组织样本，在每个步骤中准备相应体积的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

• 小瓶 1 : 1 瓶，500 毫升：无菌不含钙和镁的汉克平衡盐溶液 (CMF HBSS)，pH 7.4。除了用作解离的介质外，该溶液还用于重构小瓶 #2 和 #3 的内容物。

• 小瓶 2：5 小瓶，每瓶 1000 µg：Worthington 胰蛋白酶（代码：TRLS），3X 结晶，用 1mM HCl 透析，通过 0.22 微米孔径的膜过滤，并冻干。使用前，用 2ml CMF HBSS（1 号小瓶）复溶并轻轻旋转以溶解内容物。储存在 2-8°C。

• 小瓶 3： 5 小瓶，每瓶 2000 µg：Worthington 大豆胰蛋白酶抑制剂（代码：SIC），一种 0.22 微米孔径的膜过滤冻干粉末。使用前，用 1ml CMF HBSS（1 号小瓶）复溶并轻轻旋转以溶解内容物。储存在 2-8°C。

• 小瓶 4：5 小瓶，每个 1500 单位：Worthington 纯化胶原酶（代码：CLSPA），一种 0.22 微米孔径膜过滤的冻干粉末，经过色谱纯化。它每毫克含有少于 50 个酪蛋白酶单位，由两种可分离但非常相似的胶原酶组成。使用前，用 5ml Leibovitz L-15 培养基（如下所述制备）复溶并轻轻旋转以溶解内容物。储存在 2-8°C。

• 装有 Leibovitz L-15 培养基粉末的袋子：1 x 1L，通过切开信封顶部并将内容物倒入装有 800 毫升细胞培养级水的烧杯中来重构袋子的全部内容物。用额外的 100 毫升冲洗袋子 2-3 次。使总体积达到 1 升并通过 0.22 微米孔径的过滤器过滤。

该试剂盒还包括 5 个细胞过滤器 (Falcon)，这是一张将酚红颜色与 pH 值相关联的卡片，用于检查平衡盐溶液和培养基。

艾美捷 Worthington新生儿心肌细胞分离系统参考文献：

1.Engelmann, G., McTiernan, C., Gerrity, R., Samarel, A.： 技术 2 , 279, 1990

3.Fratalli, V. 和 Steiner, R.： 大豆抑制剂。一、从商品粗制大豆胰蛋白酶抑制剂中分离出三种抑制剂及其一些性质 ， 生物化学 7 , 521, 1968

4.Freshney, R. Ian： 《动物细胞培养基本技术手册》，第 4 版。,, Wiley-Liss, Inc., 纽约, , 2000

5.Gross, W.、Schopf-Ebner, E. 和 Bucher, O.： 分离心肌细胞均质培养物的制备技术 ， Exp Cell Res 53 , 1, 1968

Worthington主要研究覆盖生物技术和生命科学研究，诊断，生物制药和生物加工应用的高质量纯化酶，蛋白质，核酸和试剂盒。艾美捷科技是Worthington的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/brand/Worthington.shtml

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ProSci LAG3抗体：改善体外研究，助力癌症免疫治疗

法国免疫学家Triebel于1990年首次发现LAG-3免疫控制机制，他的研究小组首次证明，可溶性的LAG-3分子通过MHC II信号传导激活抗原呈递细胞，促使抗原特异性T细胞反应。然而，关于MHC II分子是否单独调控LAG-3的抑制功能还存在争议。  

淋巴细胞激活基因-3（LAG-3，LAG3）是免疫球蛋白超家族的成员，以高亲和力结合MHC II类，负调节T细胞功能和稳态。它在B、T、NK细胞、单核细胞和树突状细胞中表达，并起到调节T细胞增殖的作用。LAG-3也是一种重要的免疫检查点蛋白，抗LAG-3抗体可激活T效应细胞并影响调节性T细胞功能。此外，LAG-3似乎与PD-1/PD-L1以协同方式发挥作用，这表明双抗体方法可能在癌症免疫治疗中被证明是有用的。  

艾美捷ProSci 特色免疫检查点研究相关：LAG3抗体（仅限用于科研学术研究用途，不得用于医疗与诊断）旨在改善体外研究。与使用酵母或细菌中制造的蛋白质开发的抗体不同，这些LAG-3抗体是使用哺乳动物细胞系中表达的抗原开发的，对蛋白质进行天然的翻译后修饰。可以应用于已测试验证过的应用类型。

图：LAG-3在高表达HEK293细胞中的免疫荧光研究使用2μg/ml的LAG-3抗体。

艾美捷ProSci LAG3抗体相关研究方案：

LAG3 Antibody [2G8] RF16082 鼠单抗 E, Flow, ICC, IF, IHC-P, WB

LAG3 Antibody [7A7] RF16083 鼠单抗 E, Flow, ICC

LAG3 Antibody [9F9] RF16084 鼠单抗 E, Flow, ICC, IF, IHC-P

LAG3 Antibody [6B12] RF16086 鼠单抗 ICC, IF, IHC-P

LAG3 Antibody [6D1] RF16087 鼠单抗 ICC, IF, IHC-P

LAG3 Antibody [5F11] RF16088 鼠单抗 E, Flow, ICC, IF, IHC-P, WB

LAG3 Antibody [1G4] RF16089 鼠单抗 E, Flow, ICC, IF, IHC-P, WB

LAG3 Antibody 8655 兔多抗 E, IF, IHC-P, WB

LAG-3 Recombinant Protein RF16080-01 重组蛋白 biological assays

来源：https://www.amyjet.com/products/PSI-RF16083.shtml