百萤问号-----Cy系列荧光染料问答

Cy(Cyanine)染料,也叫花青染料，是一系列在实验中很常见的荧光化合物。跟着百萤一起看看它们是怎么工作的吧！

1.问：Cy3、Cy5、Cy7是什么？光谱特性如何？适用于哪些应用？

答：Cy3、Cy5和Cy7是一类荧光染料，常用于生物科学研究中的荧光标记和成像。它们属于氰化染料家族，可以在特定波长下吸收光能，并在不同波长下发射特定颜色的荧光信号。

Cy3的最大吸收波长约为550纳米，最大发射波长约为570纳米；Cy5的最大吸收波长约为650纳米，最大发射波长约为670纳米；Cy7的最大吸收波长约为750纳米，最大发射波长约为770纳米。

Cy3、Cy5和Cy7广泛应用于分子生物学和细胞生物学研究中的荧光标记。它们常用于荧光显微镜观察、流式细胞术、免疫荧光染色、蛋白质和核酸定量等实验中。

2.问：Cy3NHS酯在动物活体实验中的注意事项有哪些？

答：（1）Cy3标记物在使用前需要稀释到合适的浓度和pH值。一般推荐使用PBS或TBS缓冲液稀释，避免使用含有氨基或巯基的缓冲液或添加剂，以防止与Cy3发生反应或还原。Cy3标记物的稀释比例根据实验目的和条件而定，一般在1:200-1:1000之间。

（2）Cy3标记物在使用过程中需要避免光照和高温，以防止荧光淬灭或降解。Cy3标记物可以在4°C避光保存数月，或者在-20°C避光保存数年。如果需要冻存，可以加入适量的甘油或DMSO作为冻存保护剂。

（3）Cy3标记物在动物实验中可以用于尾静脉注射，进行活体成像。每次注射200μL（浓度0.5 mg/mL），每5分钟记录一张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。

3.问：磺化和非磺化的Cy3有什么区别？哪个更适合蛋白染色？

答：磺化的Cy3和非磺化的Cy3的主要区别是水溶性和标记方法。磺化的Cy3在发色团上有两个硫酸离子官能团，所以它的水溶性很高，可以直接在水溶液中进行标记反应，不需要有机溶剂助溶1。非磺化的Cy3的水溶性较低，需要预先溶解在有机溶剂（如DMF或DMSO）中，然后加入到生物分子的水溶液中反应。如果被标记的蛋白质对有机溶剂敏感，或者需要通过透析纯化，那么磺化的Cy3是更好的选择。另外，磺化的Cy3也有更好的光学稳定性和量子产率，发出的荧光更强更耐光照。两种Cy3的荧光谱图几乎一样，只是磺化的Cy3有微小的蓝移。因此，在大多数情况下，两种Cy3可以相互替换使用。百萤生物提供多种基团的Cy染料，欢迎选购

4.问：Cy3标记植物组织和动物组织，在实验操作上有什么区别？

答：Cy3标记植物组织和动物组织在操作上的区别可能取决于不同的实验目的和方法，但是一般来说，有以下几点需要注意：

（1）植物组织通常有较厚的细胞壁，可能影响染料的渗透和结合。因此，在标记前可能需要用酶或机械方法处理植物组织，增加其渗透性；

（2）植物组织和动物组织的pH值可能不同，这可能影响染料的稳定性和荧光强度。因此，在选择缓冲液时，需要考虑目标组织的pH值，并且避免使用含有氨基的缓冲液，如Tris或甘氨酸，以免与染料竞争反应；

（3）Cy3染料有脂溶性和水溶性两种类型，脂溶性染料需要加入有机溶剂助溶，而水溶性染料不需要，水溶性染料通常更稳定，更适合标记对有机溶剂敏感的生物分子；

（4）Cy3染料可以与生物分子上的氨基反应形成稳定的酰胺键，因此在标记时需要控制反应条件和比例，以达到理想的标记效率和荧光信号。一般来说，Cy3染料与目标分子的摩尔比在4-12之间为宜。

5.问：Cy5 马来酰亚胺能否标记外泌体？如何操作？

答：Cyanine 5 maleimide是一种荧光染料，常用于对含有巯基的蛋白质或肽链进行标记。该产品可以标记外泌体，以下是一般的标记步骤：

（1）准备外泌体样品：收集并纯化外泌体样品，确保样品的纯度和完整性。

（2）选择适当的缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液（PBS）。

（3）制备Cyanine 5 maleimide工作溶液：根据说明书，将Cyanine 5 maleimide溶解在适当的溶剂中，制备成工作浓度的溶液。

（4）反应标记：将外泌体样品与Cyanine 5 马来酰亚胺工作溶液混合，使其反应。反应时间和温度可以根据实验需求进行优化，一般在室温或较低温下进行。

（5）反应停止：添加还原剂（如二巯基乙醇）以停止反应，并消除未反应的Cyanine 5 马来酰亚胺。

（6）清洗和去除未结合的染料：使用适当的洗涤缓冲液，如PBS，对标记后的外泌体样品进行洗涤，以去除未结合的染料。

（7）分析和评估：使用荧光显微镜、流式细胞术或其他适当的技术，对标记后的外泌体样品进行荧光检测和分析。

参考文献：Pishesha, N.; Harmand, T.; Smeding, L.; Ma, W.; Ludwig, L.; Janssen, R.; Islam, A.; Xie, Y.; Fang, T.; McCaul, N.; Pinney, W.; Sugito, H.; Ploegh, H. Single domain antibody-antigen adducts that target Class II MHC induce antigen-specific tolerance. Research Square, preprint. doi: 10.21203/rs.3.rs-192181/v1

6.问：Cy3酸和NHS酯有什么区别？适用性有什么不同？

答：Cy3 acid（货号140）和NHS酯（货号141）都是一种黄色荧光染料，用于标记生物分子中的氨基。它们的区别在于反应基团的不同。Cy3 acid是一种羧酸，可以与活化剂（如EDC）反应，形成活化羧酸，再与氨基反应。Cy3 NHS酯是一种N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS酯），可以直接与氨基反应，形成稳定的酰胺键。

Cy3 acid和NHS酯的适用性也有不同。Cy3 acid可以用于标记含有羧基的分子，如核酸，通过转化为NHS酯或其他活化形式。Cy3 NHS酯可以用于标记含有氨基的分子，如蛋白质，多

肽，或氨基修饰的核苷酸。Cy3 NHS酯比Cy3 acid更方便使用，因为不需要额外的活化步骤。

7.问：Cy3马来酰亚胺常用于什么染色？它和Cy3NHS酯的区别是什么？

答：Cy3马来酰亚胺（货号142）常用于标记含有巯基的生物分子，比如半胱氨酸和双硫键等，然后用荧光显微镜或荧光酶标仪观察或检测它们的荧光信号。它和Cy3NHS酯（货号141）的区别主要在于：

（1）Cy3马来酰亚胺可以和巯基反应，而Cy3NHS酯可以和胺基反应。

（2）Cy3马来酰亚胺的标记反应比Cy3NHS酯的标记反应更快、更高效、更特异。

（3） Cy3马来酰亚胺的水溶性较低，需要使用有机共溶剂，而Cy3NHS酯的水溶性较高，不需要使用有机共溶剂。

8.问：Cy3NHS酯和Cy3双NHS酯在蛋白染色方面有什么区别？

答：在染色方面的区别主要是：

Cyanine 3 双NHS酯（货号138）含有两个NHS基团，可以与两个氨基反应，形成双缀合物。这种染料可能会在一些蛋白质上产生更高的荧光信号，但也可能会增加非特异性结合的风险。

Cyanine 3 NHS酯（货号141）含有一个NHS基团，只能与一个氨基反应，形成单缀合物 。这种染料是一种常用的染料，可以与多种生物分子发生共价结合，但也可能会降低荧光信号的强度。

对于Cyanine 3 双NHS酯，常用于标记含有多个氨基的生物分子，如多肽、蛋白质、寡核苷酸等，也可以用于高灵敏度的荧光检测，因为Cyanine 3 双NHS酯在与蛋白质结合后荧光大幅度增强。

Cy3 双NHS酯注意事项：

（1）避免与含有羧基或硫醇基的生物分子反应，因为这些基团可能会与NHS基团竞争，导致非特异性结合或副反应。

（2）避免在强酸或强碱的条件下使用，因为这些条件可能会破坏染料的结构或荧光性能。

9.问：Cy3酰肼可以用于哪些应用领域？

答：Cyanine 3 酰肼（货号146） 可以与含有醛基或酮基的分子反应，形成稳定的酰肼键。这种染料可以用于标记经过过氧化物酶氧化后的抗体和其他糖蛋白，或者标记受到氧化应激或脱氨作用的蛋白质，或者标记还原性的糖类。Cy3 NHS酯（货号141）可以与含有氨基的分子反应，形成稳定的酰胺键。这种染料可以用于标记多肽、蛋白质和寡核苷酸中的氨基末端或伯胺。如果需要该类产品进行蛋白/抗体染色，请根据目标的反应基团和功能基团，按

需选择。

10.问：Cy3NHS酯标记蛋白或抗体后，如何高效纯化？

答：（1）（实验常用）用凝胶过滤层析法：将标记反应液通过大小孔径合适的凝胶过滤柱，用适当的缓冲液洗脱，收集流出液中的Cy3-蛋白标记物，并测定蛋白浓度和荧光强度。这种方法简单快速，但可能会造成一些蛋白损失或稀释。

（2）用逆相高效液相色谱法（RP-HPLC）：将标记反应液通过逆相C18柱，用不同比例的水和有机溶剂（如乙腈或甲醇）作为流动相进行梯度洗脱，收集适当的色带峰，冷冻干燥后得到Cy3-蛋白标记物。这种方法可以有效地分离和纯化Cy3-蛋白标记物，但需要专业的仪器和操作技术。

（3）用亲和层析法：如果待标记的蛋白具有特定的亲和性，可以利用亲和层析法进行纯化。例如，如果待标记的蛋白是抗体，可以用蛋白A或蛋白G柱进行纯化；如果待标记的蛋白是GST融合蛋白，可以用谷胱甘肽柱进行纯化。这种方法可以保留蛋白的活性和稳定性，但需要特定的亲和配体和缓冲液。

11.问：Cy3链霉亲和素和Cy3NHS酯在蛋白的标记方面有何区别？

答：Cy3链霉亲和素（货号16912）是一种将Cy3荧光染料与链霉亲和素（streptavidin）结合的偶联物，可以用于检测生物素化的生物分子，例如抗体、配体或DNA探针。

它可以用于间接标记法，即先用生物素化的一级抗体或其他生物素化的探针与目标蛋白结合，然后用Cy3链霉亲和素与生物素结合，产生荧光信号。

Cy3链霉亲和素的操作方法取决于所使用的生物素化探针的类型和浓度，一般来说，需要先将样品与生物素化探针孵育，然后用PBS或其他适当的缓冲液洗涤去除多余的探针，再加入适量的Cy3链霉亲和素孵育，最后再次洗涤去除多余的偶联物，就可以进行荧光检测了。

12.问：Cy3叠氮化物和炔烃有什么关系？这两个产品如何标记蛋白？

答：Cy3炔烃（货号144）和叠氮化物（货号143）可以在铜催化下发生[3+2]环加成反应，生成1,4-二取代的1,2,3-三唑衍生物，这种衍生物是Cy3染料的一种形式。

这种反应属于点击化学的范畴，因为它是高效、选择性和正交的，即它不会受到其他官能团的干扰，也不会产生副产物。

Cy3炔烃和叠氮化物可以用来标记蛋白的方法是，将含有Cy3炔烃的蛋白和含有叠氮化物的标记分子（如抗体或其他配体）在铜催化下发生点击化学反应，形成稳定的三唑连接，从而实现蛋白的荧光标记。

这种方法的优点是，它可以在温和的条件下进行，不会破坏蛋白的结构和功能，而且反应选择性高，不会受到其他官能团的干扰。 另外，Cy3染料是一种亮度高，荧光稳定，对pH不敏感的橘黄色荧光染料，它可以用532 nm激光线激发，并用TRITC滤光片组观察。

13.问：Cy3 TCO是什么？它与Cy3 NHS相比有什么区别？

答：Cy3反式环辛烯 [Cy3 TCO]（货号900）是一种荧光染料，可以与四唑类化合物发生快速的点击反应，形成稳定的共轭物。Cy3 TCO的优点是反应速度快，无毒，适用于多种生物体系。缺点是染料分子较大，可能影响标记分子的活性或稳定性。

Cy3反式环辛烯 [Cy3 TCO]和Cy3 NHS酯 [Cy3 NHS]是两种不同的荧光染料，它们都可以用于标记含有氨基的生物分子，但是它们的反应机制和条件有所不同。Cy3 TCO是一种点击化学试剂，它可以与四唑类化合物发生快速的无副产物的环加成反应。这种反应可以在水相或有机相中进行，不受pH、温度、缓冲液等因素的影响。Cy3 NHS酯是一种活化酯试剂，它可以与氨基形成酰胺键3。这种反应需要在pH 7-9的缓冲液中进行，且受到水解、氨基竞争等因素的影响。因此，Cy3 TCO比Cy3 NHS酯具有更高的反应效率和选择性，更适合标记活性或稳定性较低的生物分子。所以如果需要标记含氨基的生物分子，选择不止Cy3NHS酯，Cy3 TCO也许是您实验的更优良选择，考虑自己的实验条件，选择最佳产品，可以事半功倍。

 14.问：Cy3四嗪是什么？它与其他常见的Cy3染料有何不同？

答：Cy3 tetrazine（货号910）和其他Cy3染料的主要区别在于它们的反应基团和反应方式。Cy3 tetrazine是一种带有四唑基团的荧光探针，它可以与TCO（反式-环辛烯）或其他应力烯烃发生特异性的点击化学反应，形成稳定的生物结合物。这种反应具有快速、高效、无毒和无铜的优点。

15.问：PE-Cy5 Tandem和普通的Cy5染料相比，有什么优势？

答：（1）PE-Cy5 Tandem（货号2610）与FITC、PE在光谱上重叠范围小，荧光干扰少，因此实验中常将PE-Cy5 Tandem与FITC、PE搭配使用。普通的Cy5染料与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。

（2）PE-Cy5 Tandem具有较高的荧光强度和稳定性，可用于标记表达水平较低的蛋白。普通的Cy5染料的荧光强度和稳定性较低，适用于标记表达水平较高的蛋白。

（3）二者的染色步骤类似，主要根据蛋白的表达水平选择适合自己实验的产品。

16.问：Cy5DIGE NHS酯是什么？它和Cy5NHS酯有什么区别？

答：Cy5DIGE NHS ester（货号25306）是一种专门用于差异凝胶电泳（DIGE）分析的染料，它可以与C2DIGE和/或C3DIGE一起使用，来比较两个或三个样品中的蛋白质表达。Cy5DIGE NHS ester具有完美的迁移匹配和高分辨率的蛋白质检测能力。Cy5NHS则是一种更通用的染料，它可以用于标记核酸分子（DNA和RNA）以及其他生物分子。