AT 550 琥珀酰亚胺酯-高质量胺反应染料

AT 550 琥珀酰亚胺酯-高质量胺反应染料

AT NHS酯很容易与蛋白质的氨基反应。我们拥有提供各种高质量的胺反应染料，用于标记蛋白质和其他含胺底物。染料的光谱范围从紫外350nm到近红外750nm。常用的胺反应试剂是N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯。NHS酯很容易与含有氨基的化合物反应，在染料和蛋白质之间形成化学稳定的酰胺键。然而，氨基必须是非质子化的才能具有活性。因此，必须将溶液的pH调节到非常高的水平，以获得高浓度的未质子化氨基。另一方面，NHSesterscan还与溶液中的氢氧根离子反应，导致形成不再具有活性的“游离”染料。由于不可避免的水解速率会随着氢氧根离子的浓度而增加，因此pH值应保持在较低的范围内。pH 8.3的缓冲溶液已被发现是这些冲突需求之间的一个很好的折衷方案

艾美捷AT 550 琥珀酰亚胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

规格：1 mg

储存：储存温度为-20°C，避光保存。

形态：结晶固体

储存条件：储存温度为-20°C，避光。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少12个月

AT 550 琥珀酰亚胺酯规格：

MW：包括抗衡离子的染料的分子量，单位为g/mol；M+：染料阳离子的分子量（HPLC_MS乙腈/水0.1vol-%三氟乙酸）；∆m： 与AT染料NHS酯结合时分子质量的增加；∆q： 与AT染料NHS酯结合的电荷增加；εmax：最长波长吸收最大值下的摩尔十年消光系数M-1cm-1；CF260=ε260ε/最大值；CF280=ε280ε/最大值

用AT NHS标记蛋白质的建议方案：

AT NHS酯很容易与蛋白质的氨基反应。NHS酯结合的最佳pH范围是pH

8.0-9.0。在这个pH范围内，蛋白质的氨基，特别是赖氨酸的氨基，被充分去质子化以进行快速偶联。

所需材料：

溶液A:PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）：将8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸馏水中。

溶液B:0.2 M碳酸氢钠溶液，用2 M氢氧化钠将pH调节至9.0。

溶液C：将20份溶液A与1份溶液B混合，得到pH为8.3的标记缓冲液。将此溶液储存在密封瓶中，以保持长期稳定性。

溶液D：将1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul无水无胺二甲基亚砜（DMSO）中，或

乙腈。

染料原液的制备与处理

在测定染料储备溶液的浓度时，我们建议取等量的样品，用酸化乙醇（0.1体积%三氟乙酸）稀释，以避免染料聚集，在某些情况下（AT 565和AT 590），避免无色内酯的形成。根据溶剂的质量，这种储备溶液在室温下不稳定，必须在20℃下避光保存。

活性分子可能发生水解并失去活性。我们建议尽可能在开始标记反应之前立即新鲜制备染料原液。应当注意的是，诸如DMSO或DMF的溶剂应当不含亲核性和/或碱性杂质。这些化合物可以与NHS酯官能团反应，降低偶联效率。

缀合物制备

蛋白质溶液不能含有任何含胺物质，如Tris、游离氨基酸或铵离子。溶解在胺缓冲液中的抗体应针对溶液A进行透析，并且通过溶液C中描述的步骤实现8.3的期望偶联pH。

1、为了实现2-3的平均标记度（DOL）（染料与蛋白质的比例），在轻轻摇动的同时，向蛋白质溶液中轻轻添加三倍摩尔过量的活性染料（溶液D）。由于蛋白质和标记试剂之间的反应性不同，可能会发生变化。在反应过程中有必要优化染料与蛋白质的比例，以获得所需的DOL。必须使用更高比例的NHS酯和蛋白质来提高标记效率，反之亦然。

2、将反应混合物在室温下避光培养1小时。对于AT565-NHS和AT590-NHS，我们建议在环境温度下培养18小时以完成反应。

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AT 655 琥珀酰亚胺酯/AT 655 NHS Ester

琥珀酰亚胺酯（SE，也称为 NHS 酯）与伯胺反应，例如蛋白质中的赖氨酸残基。 琥珀酰亚胺酯标记通常用于结合蛋白质和抗体。 该反应需要目标蛋白上的胺基去质子化并与 SE 反应的碱性 pH，通常在 pH 8.3 的碳酸氢盐缓冲液中进行。 琥珀酰亚胺酯染料具有在水存在下随时间水解的缺点。 多磺化染料，例如 Alexa Fluor® 染料、DyLight® 染料和 IRDye® 尤其具有吸湿性，会加剧水解问题。

艾美捷AT 655 琥珀酰亚胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

规格：1 mg

储存：在-20°C下储存，避光

形态：结晶固体

光谱特性：见上文

储存条件：储存温度为-20°C，避光。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少12个月。

用AT NHS标记蛋白质的建议方案：

AT NHS酯很容易与蛋白质的氨基反应。NHS酯结合的合适pH范围是pH

8.0-9.0。在这个pH范围内，蛋白质的氨基，特别是赖氨酸的氨基，被充分去质子化以进行快速偶联。

AT 655 琥珀酰亚胺酯所需材料：

1、溶液A:PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）：将8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸馏水中。

2、溶液B:0.2 M碳酸氢钠溶液，用2 M氢氧化钠将pH调节至9.0。

3、溶液C：将20份溶液A和1份溶液B混合，得到pH为8.3的标记缓冲液。将该溶液储存在密封瓶中，以保持长期稳定性。

4、溶液D：将1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul无水、不含胺的二甲基亚砜（DMSO）或乙腈中。

蛋白质结合物的储存

通常，缀合物的储存条件应与未修饰蛋白质的储存条件相同。当溶液在4℃下储存时，建议添加叠氮化钠作为防腐剂（最终浓度为2mM）。在将缀合物添加到活细胞标本中的应用中，可能需要在使用前去除防腐剂以避免抑制作用。缀合物应在4C下稳定数月。对于长期储存，溶液可以分成等分试样，并在-20°C下冷冻。避免重复冷冻和解冻。染料偶联物应尽可能存放在避光的地方。

确定平均标记度（DOL）

平均标记度（DOL）表示染料分子与蛋白质分子的比例，可以通过吸收光谱法使用朗伯-比尔定律来确定：吸光度（A）=消光系数（e）×摩尔浓度x路径长度（d）。在石英（紫外透明）比色皿中凝胶过滤后，只需测量共轭溶液的紫外-可见光谱。如果溶液浓度过高，无法准确测量吸光度，则可能需要稀释溶液。在染料的最大吸收波长（abs）和280nm（A280）（蛋白质的最大吸收率）下测量吸光度（Ama）。染料浓度的计算公式为：c（染料）=Ama/Emx x d，其中Ema是染料在最大吸收波长下的消光系数。类似地，基于280 nm处的吸光度，使用公式确定蛋白质浓度：c（蛋白质）=Apot/Eprot x d，其中Eprot是280 nm处蛋白质的消光系数。由于所有染料在280nm处都具有一定的吸光度，因此必须根据染料的贡献来校正在A280处测量的吸光度。蛋白质浓度可计算为：Aprot=A28o-Amax×CF²8o，然后c（蛋白质）=Anot/Eprotxd。标记程度，代表与蛋白质分子结合的染料分子的平均数量，可以基于

关于上述关系。

仅供研究使用，不用于人类或临床诊断

https://www.amyjet.com/products/B-CHM505-5mg.shtml

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His标签蛋白纯化试剂盒：快速、高效、高特异性

Propure™ His-Tag-Ni-NTA树脂能承受一定浓度的还原剂、变性剂或偶联剂等恶劣条件，能简单、快速、高效、高特异性地纯化His-Tag-蛋白。Propure™ His Tag-Ni-NTA树脂能够有效地从可溶性蛋白质提取物中纯化聚组氨酸标记的蛋白质。该树脂由固定在4%交联琼脂糖上的带镍的次氮基三乙酸（NTA）螯合物组成。Ni NTA树脂通常被选择用于His标记的蛋白质纯化，因为螯合物上有四个金属结合位点，这允许高结合能力和低金属离子浸出

艾美捷His标签蛋白纯化试剂盒：

Cat #: D-AKTP201

Size: 1 mL/1 mL*5

Storage: Stable for 12 months at 4°C

His标签蛋白纯化试剂盒样品制备：

A从细菌或酵母中提取蛋白质

1.诱导蛋白质表达后，将细菌或酵母培养基转移到离心管中，在

7000转/分以收集细菌或酵母。

2.与10倍体积的裂解缓冲液（收集的细菌或酵母：裂解缓冲液=1:10）混合，加入最终浓度为1mM的PMSF。建议添加最终浓度为0.2-0.4mg/mL的溶菌酶。

3.对细胞进行复苏。如果细胞浓度较高，则添加10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I。将悬浮液混合并在冰中浸泡，保持裂解液清洁。

4.将干净的裂解物转移到新的离心管中，以10000rpm，4C离心20-30分钟。取上清液，在-20℃的冰上储存。

B从酵母、昆虫或哺乳动物细胞中提取的可溶性蛋白质

1.将细胞培养基转移到离心管中，以5000rpm离心10分钟以收集悬浮液。如果悬浮液中含有EDTA、组氨酸和其他还原剂，则应使用赖氨酸缓冲液对悬浮液进行透析。

2.大体积悬浮液应采用硫酸铵分级沉淀法浓缩，然后用赖氨酸缓冲液透析。

C用于在变性条件下纯化的包涵体蛋白质提取

1.将培养基转移到离心管中，以7000rpm离心15分钟以收集沉淀。拆下悬架。

2.与10倍体积的赖氨酸缓冲液混合，如收集的沉淀：赖氨酸缓冲剂=1:10（W/N）。裂解缓冲液不含8M尿素。恢复降水。将悬浮液在冰中混合并超声处理。

3.将裂解物转移到新的离心管中，在10000rpm、4℃下离心20-30分钟。处理上清液，再次重复步骤2和3。

4.与10倍体积的赖氨酸缓冲液混合，如收集的沉淀：赖氨酸缓冲剂=1:10（W/N）。在变性条件下，重新悬浮培养液进行纯化。

通常，在需要用金属离子重新充电之前，Ni NTA树脂可以至少使用五次。当背压过高或容量显著降低时，需要剥离金属离子，并按照以下程序对树脂充电：

1.用5个树脂床体积的去离子水洗涤树脂；

2.100mM EDTA（pH 8.0），5个树脂床体积；

3.用10个树脂床体积的去离子水洗涤树脂；

4.用5个树脂床体积的0.5M NaOH洗涤树脂，并停留10-15分钟；

5.用10个树脂床体积的去离子水洗涤树脂；

6.100mM Nitso8324；3-5个树脂床体积；

7.用10个树脂床体积的去离子水洗涤树脂；再生后，培养基可以立即使用，也可以在4°C下储存在含有20%乙醇的PBS中。

His标签蛋白纯化试剂盒化学相容性：

https://www.amyjet.com/products/D-AKTP201-1mL.shtml

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T7 RNA聚合酶/T7 RNA Polymerase的适用范围

T7 RNA聚合酶是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。

T7 RNA 聚合酶可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T7启动子有高度的特异性。

艾美捷T7 RNA聚合酶:

英文名字：T7 RNA Polymerase

货号：C-BSM0124

规格：5000 U / 25000 U

组成：T7 RNA Polymerase (50 U/μl)/10×T7 RNA Polymerase Buffer

纯度：SDS-PAGE检测结果大于95%。

核内残留物：将20 U T7 RNA聚合酶与超螺旋质粒DNA在37°C下孵育4小时，DNA电泳未检测到质粒的变化

残留DNA酶：将T7 RNA聚合酶与双链DNA在37°C下孵育16小时，DNA电泳未检测到DNA变化。

RNase残基：将T7 RNA聚合酶与RNA在37°C下孵育1小时，电泳中未检测到RNA降解

T7 RNA聚合酶适用范围：

1. 合成单链 RNA，包括 mRNA，siRNA，gRNA 等各类 RNA 的前体。

2. 合成标记或未标记的高特异性 RNA 探针。

3. 利用帽子类似物合成加帽的 mRNA。

T7 RNA聚合酶可分为：常规型和耐热型。常规型T7 RNA聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录，而耐热型T7 RNA聚合酶可在更高的温度下（37-52℃）进行体外转录。

T7 RNA聚合酶使用方法：

推荐的反应条件：

在37°C下培养1小时。如果转录物长度小于300nt，反应时间可以延长至2-16小时。反应结束后，在上述20μl反应混合物中加入1μl双脱氧核糖核酸酶，并在37°C下孵育15分钟以移动DNA模板

https://www.amyjet.com/products/C-BSM0124-5000U.shtml

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异硫氰酸荧光素标记，高吸收、优良的荧光量子产率

异硫氰酸荧光素是生化试剂,也是医学诊断药物,主要用于荧光抗体技术中的荧光染料,能和各种抗体蛋白结合,结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性,并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学,农学和畜牧等方面,可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

FITC，英文全称Fluorescein Isothiocyanate，中文名称异硫氰酸荧光素，具有高吸收率、优良的荧光量子产率和良好的水溶性等特点，是生物学中应用非常广泛的一种绿色荧光素衍生物，其异硫氰酸基团可与蛋白的氨基末端或者伯胺反应从而实现包括抗体，凝集素在内的蛋白标记。除了用作蛋白质标记物，还可用作蛋白质荧光示踪剂，标记抗体用以快速鉴定病原体，以及用于蛋白质和多肽（HPLC）的微量测序。FITC为黄-橙色粉末，最大激发波长为494 nm。一旦激发，在最大发射波长520 nm处呈黄-绿色荧光。

FITC有两种异构体，异构体I（Isomer I）和异构体II（Isomer II）,二者在光谱性质上基本没有差异（无论是波长还是光强度），但是前者更易纯化，所以相对便宜，应用也较为广泛。对于大部分应用，混合型的FITC已能很好的满足实验要求。本品纯度：≥95%，适合用于蛋白质标记。

艾美捷异硫氰酸荧光素：

Cat #: B-CHM100

规格：100 mg

储存：储存温度为-20°C，避光保存。

配方：C₂₁H₁₁NO₅S

兆瓦：389.38

纯度：≥95%（HPLC）

光谱特性：Ex/Em=490/525 nm

外观：黄色粉末

运输和储存：

储存条件：储存温度为20°C，避光。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少12个月。

异硫氰酸荧光素标记的抗体方案：

1、将待交联的蛋白质（浓度：1mg/mL）在交联反应缓冲液中在4°C下透析三次，将pH调节至9.0。交联缓冲液的制备：溶解7.56 g NaHCO3，1.06 g Na₂CO3和7.36g NaCl在水中的溶液稀释至1L的最终体积。

2、将FITC以1 mg/mL的浓度溶解在二甲基亚砜中。为每次交联反应准备新鲜的FITC溶液，并避免暴露在光下。

3、将FITC缓慢添加到抗体溶液中，比例为P：F（蛋白质：FITC）=1 mg：150μg。轻轻混合溶液，同时加入FITC，以确保与抗体均匀混合。让反应在黑暗中在4℃下进行8小时。

4、添加5 mol/L NH₄Cl最终浓度为50 mmol/L，在4°C下停止反应2小时。

5、将缀合物相对于PBS溶液透析至少四次，直到透析液变得清澈为止。

6、交联材料的特性：

蛋白质浓度（mg/mL）=[A280-0.31×A₄gs]/1.4

F/P比：3.1×A₄gs/[A280-0.31×A₄gs]。该值应介于2.5～6.5之间。

7、将FITC蛋白偶联物储存在pH 7.4的PBS中，补充0.1%的NaN3和1%的BSA，在4°C的黑暗中储存。

https://www.amyjet.com/products/B-CHM100-100mg.shtml

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脂肪酸氧化FAO检测试剂盒的特点和保存建议

脂肪酸氧化FAO检测试剂盒以多个单独的成分（装在6个小瓶中）装运，以确保试剂在没有干冰的情况下至少一周的完整性。重建前，将试剂盒储存在4℃。请按照以下说明重新配制FAO分析溶液和20倍FAO基质溶液。

重构脂肪酸氧化FAO测定溶液（5 ml）：

1.在室温下解冻试剂1（在棕色微管中0.5毫升）。将FAO含量测定溶液（5毫升装在绿盖小瓶中）置于冰上。

2.将试剂1溶液转移到FAO分析溶液中，并立即混合溶液以防止试剂沉淀。将混合溶液放在冰上遮光。

3.轻敲试剂2小瓶（透明微管）以将内容物沉积在里面。将试剂2的内容物转移到FAO分析溶液中，并通过轻轻搅拌溶解内容物（如有必要，用一些FAO分析液冲洗干净的小瓶，以确保完全转移）。在遮光的冰上轻轻搅拌FAOAssay溶液约5分钟。重构的FAO含量测定溶液应储存在-70℃下。

重组20倍脂肪酸氧化FAO基质（0.25毫升）：

1.轻敲20 x FAO基质小瓶（透明微管），将内容物放入其中。

2.添加0.25 ml ddH₂O（在透明微管中）至20x FAO基质小瓶和涡流管以溶解内容物。重构的20倍FAO基质溶液应在-70℃下储存。

脂肪酸氧化（FAO）检测试剂盒（目录号BR00001）组件：

FAO含量测定溶液-5 ml（用于100个孔），储存在-70°C（在测定过程中遮光溶液）

20倍FAO基质（20倍辛酰基辅酶A）-0.25毫升，储存于70℃

10倍细胞裂解液-25 ml，在4C下储存（含1%TX-100；稀释前快速旋转瓶）

脂肪酸β-氧化活性测定基于辛酰基CoA的氧化，其与NADH依赖性的INT还原为INT甲zan有关。甲zan产物在492nm处表现出最大吸收（消光系数=18mm-1cm-1），允许灵敏地测量细胞/组织提取物中存在的FAO活性。请注意，FAO的活性受所用细胞/组织的线粒体含量的影响。如果储存和处理得当，套件组件至少可以稳定一年。

细胞/组织提取物的制备：

1.通过用冰冷的dH2O稀释10x细胞裂解溶液来制备1x细胞裂解溶液。Bringup在50-100μl冰冷的1x细胞裂解液中用吸管轻轻冲洗至少105个细胞。将裂解物在冰上搅拌5分钟。如果裂解液过于浑浊，则添加更多的1x细胞裂解液并重复移液。将组织在冰冷的1x细胞裂解溶液（10-20mg组织在0.5ml中）中匀浆。

2.将裂解物在冷的微型离心机中以约14000 rpm离心5分钟。上清液在-80℃下保存。

3.使用BCA蛋白测定法测定裂解物蛋白浓度。建议样品蛋白质浓度范围为1-2mg/ml。在测定过程中，始终将裂解物放在冰上。

试剂解冻：

将解冻的粮农组织分析溶液和20倍粮农组织基质置于遮光冰上。不要过度解冻。移液前轻轻搅拌溶液。尽量减少试剂解冻的时间是很重要的。使用后立即冷冻溶液。

图：从正常仓鼠心脏（F1B品系）和衰竭仓鼠心脏制备组织匀浆心脏（TO2应变）。粮农组织的检测试剂盒对粮农组织的活动进行了检测，结果表明仓鼠心脏的脂肪酸氧化能力降低。

研究领域：

对健康和病理状态下的代谢途径和过程进行研究（脂质代谢）。 研究信号转导途径； 研究遗传性疾病，例如脂肪酸氧化障碍（FAODs）； 研究心血管疾病，例如心力衰竭； 研究胎儿发育期间的细胞能量代谢； 研究脂肪酸氧化在癌症代谢中的意义。

https://www.amyjet.com/products/BR00001.shtml

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C1q/C1q补体研究：高纯补体蛋白，你值得拥有！

补体经典途径由C1启动激活，因此经典途径也称为C1激活途径。C1复合物由3个部分组成，分别是C1q，C1r和C1s，它们以1：2：2的比例形成C1复合物，是经典补体途径的第一组分。除C1q外，C1r和C1s是以酶的前体形式存在于血清中，需经过抗原-抗体复合物或其他因子激活后，才能发挥生物学活性作用。C1启动激活的过程为：抗原与抗体结合后，形成抗原-抗体复合物，C1q能识别抗体Fc的补体结合点，并与之结合。随后C1q的构型发生改变，使与C1q非共价结合的C1r活化，活化的C1r进一步激活C1s，在Mg2+存在下，活化的C1s裂解C4，由此启动经典途径。   

C1是由一个C1q分子(410kDa)，两个C1r分子(92kDa)和两个C1分子(86kDa道尔顿)组成的高分子复合物(766kDa)。当C1被激活时，C1r和C1s亚基分别裂解成两条链。  

艾美捷可提供高纯的人的C1 Complex, C1s, C1q, C1r补体蛋白：

名称 货号 规格 功能说明

C1 Complex A098 200ug/vial C1可用于制备表面含有活性C1的细胞

C1q A099 1000ug/vial 可用于包被ELISA板，用于捕获或者定量临床样本中的免疫复合物

C1r Proenzyme A101 100ug/vial C1r酶原可在钙存在的情况下与C1q和C1s酶原形成C1复合物。当C1复合物中的C1q与免疫复合物(如携带抗体的EA细胞)结合时，C1r原酶将迅速自我激活为C1r酶

C1r Enzyme A102 250ug/vial C1r酶可以激活C1s酶原

C1s Proenzyme A103 250ug/vial C1s酶原可在钙存在的情况下与C1q和C1r酶原形成C1复合物。C1s酶原没有蛋白水解活性，必须与C1r酶孵育转化为C1s酶才有活性

C1s Enzyme A104 250ug/vial 在钙存在的情况下，C1s酶仍能与C1r结合复合物也能与C1q结合。由此产生的C1q-C1r-C1s复合物是一种完全活性的C1分子，它将在流体相或在含有抗体的细胞(如EA)上激活C4和C2

https://www.amyjet.com/featured/c1-c1q-c1r-c1s.shtml

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EdU法细胞增殖成像分析试剂盒化验程序详细说明

细胞增殖导致许多重要的变化，包括DNA合成、细胞代谢增加和增殖特异性蛋白表达。基于荧光染色技术，BiogradetechEdU法细胞增殖成像分析试剂盒可以直接从DNA水平准确检测细胞增殖状态，同时还可以通过细胞代谢水平高通量检测细胞增殖状态。该试剂盒包含一个专利的增殖阴性对照，是一个完美的解决非标准化的增殖试验结果。目前主要包括EdU和CCK8两种常用的检测方法。  

艾美捷 Biogradetech EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）：

Cat #: D-AKK2030

Size: 100T

Storage: Stored at -20°C for 12 months, protected from light

EdU法细胞增殖成像分析试剂盒 供应材料和储存条件：

化验程序

A.用Edu标记细胞

在本实验中，以在96孔板中培养的粘附细胞为例。EdU孵育后可以涂抹悬浮细胞（在载玻片中加入适量细胞，用酒精灯烘烤至干燥）。涂抹后，染色程序与粘附细胞相同。

1.在平板中放置合适的盖玻片，播种适当数量的细胞，并在处理细胞后使其生长到所需的密度。

2.可选步骤：设置阴性对照：在EdU孵育前加入DNA合成抑制剂羟基脲，按1:1000的比例直接加入阴性对照孔中，混合孵育0.5小时。

用10mM的EdU溶液在介质中制备3.2×EdU工作溶液（20μM）。EdU的推荐最终浓度为10μM，用细胞培养基1:500稀释10mM EdU可获得2xEdU工作溶液（20μM）。

4.将相同体积的预热（37°C）的2xEdU溶液加入到含有测试细胞的培养基中，以将96孔板中EdU的最终浓度改变为1x。

注意：建议不要更换所有培养基，因为这会影响细胞增殖的速率；建议EdU的初始浓度为10μ。

5.在最合适的条件下培养细胞2小时（根据细胞扩增的时间，一般肿瘤细胞的培养时间为2小时）。

6.培养后，除去培养基，并向每个孔中加入0.1mL固定溶液（含有3.7%甲醛的PBS）。室温孵育15min。

7.取出固定剂，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复3次。

8.取出洗涤剂，向每个孔中加入0.1mL渗透剂（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室温下孵育15分钟。

9.去除渗透剂，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复2次。

10.转到步骤C。

B.EdU标记活体动物

本实验以6周龄小鼠为例，其他动物EdU的标记，请参阅相关文献。

1.对于小鼠，根据10-200mg/kg的剂量，EdU可以用PBS制备成一定浓度，腹膜内注射，局部注射特定组织或器官，也可以加入饮用水中。具体剂量与所用动物的类型、重量和使用方式有关，我们可以参考相关文献，因此建议首次使用时探索EdU的浓度，或直接使用50 mg/kg的强的松浓度。如果你以前在实验中使用过BrdU，你可以将BrdU的最终浓度称为EdU的最终浓缩。EdU需要单独购买。

2.可选步骤：阴性对照的设定：在EdU处理过程中加入DNA合成抑制剂羟基脲，用浓度为1000mg/kg的EdU溶液配制。羟基脲需要单独购买。

3.24小时后或根据具体实验确定的适当时间后，迅速杀死小鼠，取出必要的组织，并按照常规步骤制作冷冻切片或石蜡切片。EdU标注的时间也可以参考相关文献进行调整。

4.对于冷冻切片：

（1） 加入适量固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室温孵育15分钟。

（2） 取出固定剂，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复3次。

（3） 取出洗涤剂，向每个孔中加入0.1mL渗透剂（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室温下孵育15分钟。

（4） 去除渗透剂，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复2次。

（5） 抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫荧光染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制的合适抗原修复液进行抗原修复。

（6） 转到步骤C。

5.对于石蜡切片：

（1） 脱蜡：在二甲苯中脱蜡5-10分钟，然后换成新鲜二甲苯，然后脱蜡5-10分钟。无水乙醇脱蜡5分钟，无水乙醇脱蜡3分钟。95%乙醇3分钟.85%乙醇3分钟75%乙醇3分钟.50%乙醇3分钟PBS 5分钟。

（2） 抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫组织化学染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制合适的抗原修补液进行抗原修复。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶进行抗原修复，必须反复清洗，否则残留的酶会严重干扰后续的标记反应。

（3） 转到步骤C。

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