流式细胞仪操作规程
- 来宝网2007年6月4日 16:47 点击：4993
流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定
2：HLA-B27测定
3：CD55／CD59测定
4：血小板抗体测定
5：红细胞抗体测定
6：粒细胞抗体测定
7：白血病免疫分型测定
8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
9：XL操作步骤
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
淋巴细胞亚群测定
(CD系列)
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样） |
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报告结果 报告百分数（和绝对值） |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03 |
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临床意义 1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。 临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。 Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。 Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。 2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。 |
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方案（Protocol） |
HLA-B27测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
HLA-B27测定
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测） |
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报告结果 报告阴阳性 |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值 阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。 |
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临床意义 HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。 |
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方案（Protocol） |
CD55/CD59测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
CD55/CD59测定
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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样本制备: (一)白细胞CD55／CD59检测 1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。 2．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。 4．洗涤离心 5．上机测样 (二)红细胞CD55／CD59检测 1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。 4．洗涤离心。 5．混匀、上机测样。 |
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报告结果 报告百分数 |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值 CD55>97% CD59>97% PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒细胞CD59>84% |
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临床意义 用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。 |
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方案（Protocol） |
血小板膜表面抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
血小板膜表面抗体测定
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。 4．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作： 富集血小板法： 1）800r/min*15min,取上清， 2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。 3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC) 4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。 5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 6)洗或不洗，上机测样 全血法： 1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6） |
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报告结果 报告百分数 |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% |
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临床意义 为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。 |
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方案（Protocol） |
红细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
红细胞膜蛋白结构测定
（红细胞抗体）
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC) 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)上机测样 |
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报告结果 报告百分数 |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值 IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88% |
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临床意义 自身溶血性贫血的分型诊断 |
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方案（Protocol） |
粒细胞抗体测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共2页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
&nb,sp; 复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
粒细胞抗体测定
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3． 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 4．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 4：清洗液 液体 5：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作： 1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC) 2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心 4)上机测样 |
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报告结果 报告百分数 |
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操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 |
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参考值 IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4% |
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临床意义 白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性 |
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方案（Protocol） |
白血病免疫分型测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年 月 日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科 主任：
检验科 实验室：
白血病免疫分型测定
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方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) |
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原理： 三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管 |
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标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。 采集部位 腰穿采骨髓 抗凝剂 肝素抗凝 要求 1．样本量至少3ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。 |
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试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2— 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：IntraPrep Permeabilization Reagent 成分1（固定剂） 液体 5ml 室温 成分2（透膜剂） 液体 5ml 室温 4：鞘液 液体 5：清洗液 液体 6：荧光微球 液体 10ML 2 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2 |
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仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra |
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操作-样本制备： 细胞膜表面抗原 1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。 2．首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。 （来源： 来宝网 ）
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