免疫细胞专题之NK细胞

NK细胞概述：

自然杀伤（nature killer，NK）细胞属于天然淋巴样细胞家族，在人类中通常被定义为CD3- CD56+细胞，占循环淋巴细胞的5%～15%。NK细胞是抵御病毒感染和细胞突变的第一道防线，无需预先致敏就能杀死威胁宿主的癌细胞、异体细胞和外来病原体感染的细胞，被认为是癌症免疫监测、移植排斥和早期病毒免疫的关键效应细胞。

图 NK细胞（黄）和癌细胞（红）

NK细胞免疫疗法：

CAT免疫疗法的成功激发了研究者们利用其他免疫细胞进行癌症治疗的兴趣，简单的说细胞免疫疗法就是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量倍增，然后再回输到人体，一方面用来消除癌细胞、突变细胞，另一方面激活和增强机体免疫力，控制癌细胞的转移和复发。与CAT-T疗法相比，NK疗法可以靶向多种致病性抗原，具有更强的细胞毒性，且不分泌引发细胞因子释放综合征（CRS）的主要细胞因子，可以极大地减轻不良反应的风险，被寄予厚望。

NK细胞治疗的主要策略：

体外活化的自体或异体NK细胞、NK细胞和单抗药（如免疫检查点抑制剂）联合来诱导抗体特异的细胞毒性（如：抗EGFR的西妥昔单抗）、CAR-NK细胞免疫疗法等等。

目前尚未有NK细胞疗法上市，但其临床试验如火如荼，截止11月份clinicaltrials网站上，关于“NK Cell”的搜索结果已高达720例，目前在NK细胞疗法在已经在急性髓细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、以及胃癌、肝癌、肺癌、肠癌等实体瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。

图 clinicaltrials中“NK Cell”的搜索结果

体外扩增的NK细胞来源：

NK细胞除了从自体或异体的外周血分离获得，还可以来源于脐带血、干细胞分化等，此外，由于以上三种方式获得细胞的繁琐，在CAT-NK的研究中，不少研究者使用NK-92进行进一步的修饰，临床前研究已经取得了较好结果，值得注意的是，需要在输注前对细胞进行辐射。

人外周血NK细胞的分离纯化方案：

准备：15mL离心管（abs7102）或锥形管、Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）、人淋巴细胞分离液（abs930）。

图 爱必信人淋巴细胞分离液（abs930）

1、获取PBMC

1）准备无菌的15mL离心管或锥形管；
2）加入淋巴细胞分离液5mL；（注意：淋巴细胞分离液使用前需恢复室温，18-25℃）
3）Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）缓冲液1:1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品；
4）小心沿着壁管，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的4mL全血样品在淋巴细胞分离液上面；（注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液）
5）小心放进离心机（水平转子），4℃离心20-30min，速度为400g-1000g；（注意：离心机刹车应取消，需等待自然停止）
6）小心取出离管，切记不要震动；
7）可见上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环，为PBMC；
8）吸弃上清后，将白膜层轻轻地吸出来转移到新的离心管中；
9）用PBS重悬，室温，300g离心10min，重复操作2次，弃去上清，用少量PBS重悬。

2、NK细胞的纯化

NK细胞纯化最常用的方式是磁珠分选，包括阳性分选和阴性分选两种，人NK细胞发育阶段主要基于CD34、CD117、CD56和CD94的表达水平。CD56表达增加是NK成熟的关键，CD56+和CD16+可以鉴别和分离不受其他淋巴细胞污染的NK细胞。此外，白细胞介素2/15受体β（CD122）也是NK细胞发育后期的重要标志。

3、NK细胞培养

1）将纯化后的NK细胞用免疫细胞无血清培养基（abs9772）重悬，按照一定密度接种于培养皿或培养瓶中。

2）在免疫细胞无血清培养基中添加100-200IU/mL的IL-2，确保NK细胞的增值和活化并有助于提高细胞毒性，与IL-15联合应用可促进NK细胞的增殖，有利于NK细胞的激活。 

3）将细胞置于37℃的培养箱培养至少48h，再进行后续细胞功能鉴定等实验。

名词通解：

阳性筛选：磁珠结合需要筛选细胞的表面标志物，达到纯化目的。

阴形筛选：通过磁珠结合等手段除去混合物细胞中除目的细胞之外的其他细胞，以达到纯化目的。

[1] 米锦涛;袁成良.NK细胞相关免疫检查点及其抑制剂的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4645-4650.
[2] Shimasaki N, Jain A, Campana D. NK cells for cancer immunotherapy[J]. Nature reviews Drug discovery, 2020, 19(3): 200-218.