苯扎氯铵诱导的 Tenon 囊成纤维细胞的肌成纤维细胞转分化受到角膜上皮细胞共培养或白细胞介素10

青光眼的特点是视野逐渐变窄，最终导致失明。大多数抗青光眼眼药水都含有防腐剂以防止微生物的生长。苯扎氯铵（BAC）是最广泛使用的滴眼剂防腐剂。手术前长期使用含有 BAC 的青光眼滴眼液也会增加青光眼滤过手术的失败率，这种效果被认为反映了 BAC 诱导的结膜下组织纤维化。手术后滤过泡的维护仍然是青光眼临床面临的挑战。

组织驻留的成纤维细胞，以及循环祖细胞、上皮细胞和内皮细胞，有可能转分化为肌成纤维细胞，从而促进纤维化。肌成纤维细胞的特点是过度表达 α 平滑肌肌动蛋白（αSMA）、肌动蛋白应力纤维的形成以及细胞外基质（ECM）蛋白（如 I 型和 III 型胶原蛋白和糖蛋白）的过度产生，以响应各种刺激，包括损伤、感染、炎症和压力。心肌素相关转录因子（MRTF）信号通路在肌成纤维细胞的分化和激活中起重要作用。已经表明，MRTF 信号与视网膜色素上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）相关。MRTF-A 与启动子区域结合，从而调节肌成纤维细胞相关基因的表达，例如 αSMA、纤连蛋白和结缔组织生长因子（CTGF）的表达。免疫系统有助于肌成纤维细胞的调节，而抗炎细胞因子白细胞介素（IL）-10 是调节组织重塑的潜在治疗靶点。

与相应的正常组织相比，青光眼手术后滤过失败结构的组织学标本显示，αSMA 阳性细胞数量增加，I 型或 III 型胶原蛋白高密度沉积。BAC 被证明可以缩短兔青光眼滤过手术后的滤泡存活时间，并增加滤过泡中 αSMA 的表达。

角膜、结膜和眼睑维持眼表稳态并在影响每个组织的病理变化中相互作用。角膜上皮作为眼睛表面的屏障起着重要作用。这种屏障的破坏允许炎症从结膜或眼睑扩散到角膜。角膜上皮和结膜下组织也通过泪液相互连通。然而，角膜上皮对 BAC 诱导的 Tenon 囊成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的可能影响尚不清楚。

为了解决这个问题，日本山口大学医学部眼科的课题组研究了 BAC 在与猴病毒40（SV40）-永生化人角膜上皮（HCE）细胞共培养系统中对人眼 Tenon 囊成纤维细胞（HTFs）转分化为肌成纤维细胞的影响，此外还检查了释放到共培养上清液中的 IL-10 对该系统中观察到的 BAC 对 HTFs 的有害作用的可能保护机制。

BAC 对 HTFs 和 HCE 细胞的细胞毒性

首先通过测量乳酸脱氢酶（LDH）释放量来检查 BAC 对 HTFs 和 HCE 细胞活力的影响。结果发现，暴露于 BAC，HTFs 或 HCE 细胞培养基中的 LDH 量以浓度依赖性方式增加，在 BAC 浓度≥ 10 × 10^-6 % 时这种效应显著增加。因此，在 5 × 10^-6 % 的无毒浓度下用 BAC 进行了后续实验。

BAC 对 HTF 转分化为肌成纤维细胞的影响

接下来检查了无毒浓度的 BAC 对 HTFs 表型的影响。免疫荧光分析显示，BAC 诱导肌成纤维细胞分化的关键标志物 αSMA 在这些细胞中显著表达。免疫印迹分析证实，BAC 诱导 HTFs 中 αSMA 丰度显著增加（2.02 倍，与 BAC 未处理相比）。

HCE 细胞对 BAC 诱导的 HTFs 转分化为肌成纤维细胞的影响

鉴于角膜上皮和结膜下组织（包括 Tenon 囊成纤维细胞）通过泪液相互作用，于是在共培养系统中检测了 HCE 细胞对 BAC 诱导的 HTFs 的肌成纤维细胞转分化的影响。免疫荧光分析显示，在不存在 HCE 细胞的情况下，HTFs 可表达出 BAC 诱导的 αSMA ，而在与 HCE 细胞共培养的 HTFs 中，这种效应被大大抑制。这些结果通过免疫印迹分析得到证实。

BAC 对 HTF/HCE 细胞共培养系统中细胞因子释放的影响

为了探索 HCE 细胞可能抑制 BAC 诱导的 HTFs 中 αSMA 表达的机制，实验测量了释放到培养基中的 IL-6、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和 IL-10 的浓度。BAC 处理的 单独培养的 HTFs 的上清液中 IL-6 和 MCP-1 的水平显著高于 BAC 处理的 HTFs 和 HCE 细胞的共培养物中的水平。在有或没有 BAC 的情况下，HTF/HCE 细胞共培养物的 IL-6 和 MCP-1 水平没有显著差异。相比之下，BAC 处理的单独培养的 HTFs 培养基中 IL-10 的浓度仅为 BAC 处理的 HTF 和 HCE 细胞共培养中的 5.79%。同样，在有或没有 BAC 的情况下，HTF/HCE 细胞共培养物的 IL-10 水平没有显著差异。

为了检查这两种细胞类型中的哪一种可能负责产生 IL-10，实验还通过逆转录（RT）和定量聚合酶链反应（qPCR）分析在 HTFs 和 HCE 细胞共培养后 IL-10 mRNA 的丰度。虽然共培养物之间 HTFs中 IL-10 mRNA 的量在有或没有 BAC 下没有显著差异，但在 HCE 细胞中，IL-10 mRNA的表达量在BAC维持下显著增加（1.32 倍，与没有 BAC 的 HCE 相比）。

IL-10 对 BAC 诱导的 HTFs 转分化为肌成纤维细胞的影响

鉴于在存在 BAC 的情况下，HTF/HCE 细胞共培养物的培养上清液中的 IL-10 水平与单独培养的 HTF 相比增加，因此假设 IL-10 可能有助于 HCE 细胞减弱 BAC 诱导的HTFs 转分化为肌成纤维细胞。于是检查了外源性 IL-10 是否可能抑制 BAC 的这种作用。HTFs 与 IL-10（300 pg/ml）在无血清培养基中孵育 24 小时，然后再暴露于 BAC 24 小时。免疫荧光染色和免疫印迹分析表明，在存在 IL-10 的情况下，HTFs 中 BAC 诱导的 αSMA 表达基本上被消除了。

BAC 和 IL-10 对 HTFs 中 MRTF-A 亚细胞定位的影响

之前研究表明，EMT 是通过视网膜色素上皮细胞中的 MRTF-A 信号通路介导的。因此研究了 MRTF-A 信号通路是否也可能在 BAC 诱导的 HTFs 转分化为肌成纤维细胞中发挥作用。免疫荧光分析显示，在没有 BAC 的情况下，MRTF-A 主要定位于 HTFs 的细胞质，而在暴露于 BAC 的细胞中，它已易位至细胞核。重要的是，BAC 对 MRTF-A 定位的这种影响被 IL-10 抑制。免疫印迹分析证实了 BAC 诱导的 MRTF-A 易位至细胞核，并且在暴露于 IL-10 的细胞中其显著减弱 39.32%。

总之，该研究首次检查了 HTFs 和 HCE 细胞在共培养系统中的相互作用。研究发现，HCE 细胞抑制 BAC 诱导的 HTFs 转分化为肌成纤维细胞，并且 HCE 细胞的这种作用被 IL-10 模拟。尽管两种细胞类型之间这种相互作用的确切机制尚不清楚，但它可能在 IL-10 的产生水平上介导，因为 HCE 细胞存在时 HTFs 培养上清液中 IL-10 的浓度增加。BAC 还诱导 HTFs 中 MRTF-A 的核转位，并且这种作用再次被 IL-10 抑制，表明 MRTF-A 介导了 BAC 对 HTFs 转分化的影响。进一步的研究需要确定在该通路中作用于 MRTF-A 上游的蛋白，以及研究 IL-10 是否可能在体内抑制 BAC 诱导的结膜下纤维化。

参考文献：Yamashiro C, Tokuda K, Kobayashi Y, Higashijima F, Yoshimoto T, Ota M, Ogata T, Ashimori A, Kobayashi M, Hatano M, Uchi SH, Wakuta M, Teranishi S, Kimura K. Benzalkonium chloride-induced myofibroblastic transdifferentiation of Tenon's capsule fibroblasts is inhibited by coculture with corneal epithelial cells or by interleukin-10. Sci Rep. 2021 Aug 9;11(1):16096. doi: 10.1038/s41598-021-94852-8. PMID: 34373467; PMCID: PMC8352883.

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