默瑞生物成为Izon公司中国合作伙伴

       细胞外囊泡(EVs)是细胞间信息交流的重要传递者，通过传递细胞

　　间的生物学信息以调节一系列生物学过程。EVs 中包含着许多来源

　　于细胞的生物大分子，如蛋白质、mRNA 和 miRNA 等。越来越多的

　　证据表明 EVs 在许多正常的生理学和病理学过程中发挥着重要的作

　　用。许多体液中都含有 EVs，血浆作为一种易得的体液，其中包含

　　着大量的 EVs。然而，血浆是一类非常复杂的生物学样品，包含着

　　丰富的蛋白质、高/低密度脂蛋白(HDL/LDL)、盐、营养物质和各种

　　微粒，这些物质会严重干扰 EVs 的分析，因此需要在样品预处理过

　　程中进行去除。传统的 EVs 分离方法，如超速离心法和化学沉淀法，

　　获得的 EVs 纯度较低且成本较高，此外还需要特殊的设备，不适合

　　大规模的样品分析 1,2。因此，人们急需一种简单、快速、有效且成

　　本低廉的方法用于血浆中 EVs 的分离。

　　qEV 尺寸排阻柱用于血浆中 EVs 的分离

　　Izon Science 公司的 qEV 尺寸排阻柱能够实现血浆中 EVs 的快速分离。

　　该色谱柱能够除去血浆背景蛋白、脂类、其他溶解物、细胞碎片和

　　各类微粒，同时保持 EVs 的完整性和生物学特性。该方法能获得高

　　纯度的囊泡样品，有利于提高下游分析的灵敏度和准确性(如蛋白

　　和 RNA 鉴定等)。利用该色谱柱耗时 15 分钟即可获得 EVs 样品，适

　　用于后续的 qNano Gold System 分析，合计耗时小于 60 分钟。

　　材料和方法

　　首先，对病人静脉采血 4 mL 并注入含柠檬酸钠抗凝剂的 BD

　　Vacutainer®采血管。震荡均匀后对采血管进行离心(1,500 g, 20 min)

　　以除去血浆中的血细胞。将血浆上清转移至干净的试管并进行离心

　　(3,000 g, 15 min)，将血浆上清转移至干净的试管再次进行离心

　　(3,000 g, 15 min)。取 550 μL 无血小板的血浆(PFP)到 1.5 mL 的

　　小离心管*，并舍弃试管底部沉淀上方的血浆。将试管放置一边。旋

　　开 qEV 尺寸排阻柱出口的滑盖，并用 10 mL 新准备无颗粒的 PBS 溶

　　液进行冲洗。无颗粒的 PBS 溶液制备：将 PBS 小块(Sigma 公司，

　　货号 P4417-100)溶于 Milli-Q®(Millipore 公司)处理的去离子水并

　　利用 0.22 μm 滤膜过滤后得到。重新旋上柱子出口的滑盖并除去柱

　　子内填料上部残留的 PBS。将 500 μL PFP 加入 qEV 尺寸排阻色谱柱。

　　旋开 qEV 尺寸排阻柱出口的滑盖同时收集 500 μL 的馏分。馏分中的

　　EVs 和蛋白浓度分别通过 qNano Gold System 和 280 nm 处的吸光度

　　(A280)进行测定。对于包含 EVs 的馏分，利用 Pierce BCA 蛋白试

　　剂盒(Thermo Fisher Scientific)对蛋白浓度进行准确测定。

　　快速、简便和可靠的分离血浆中的 EVs

　　qEV 尺寸排阻柱能够除去血浆背景蛋白、脂类、其他溶解物、细胞

　　碎片和各类微粒，实现 15 min 内血浆 EVs 的快速分离。通过分析 qEV

　　尺寸排阻柱得到的馏分，馏分 7-9(图 1)具有单分散的粒径分布(图

　　2)，平均(mean)和众数(mode)颗粒直径分别为 115 nm 和 93 nm。

　　馏分 7 中的 EVs 具有最高的纯度(2.19E9 颗粒/μg 蛋白，表 1)，而

　　馏分 8 中 EVs 的浓度最高(3.5E10 颗粒/mL)。

 

　图 1. qEV 尺寸排阻色谱获得的馏分中 EVs 个数浓度和蛋白浓度分析。EVs

　　(粉色，馏分 7-9)与紫、蓝色(馏分 11-30)可以得到有效区分。

 

图 2. 馏分 7-9 合并样品中 EVs 的粒径分布柱状图

　　图 3. 蛋白(%)和 CD61 在馏分 7-11 中的含量(由 Anita Böing 友情提供)

　　表 1 馏分 7-9 的 EVs 和蛋白浓度

　　馏分 颗粒浓度 蛋白浓度 浓度

　　(颗粒/mL, 70-250 nm) (μg/mL)† (颗粒/μg 蛋白)

　　7 1.8E10 8.2 2.19E9

　　8 3.5E10 28.0 1.25E9

　　9 1.5E10 36.0 0.41E9

　　† qEV 尺寸排阻柱的总上样量为 45 mg 蛋白

　　Pierce BCA 分析馏分 7-9 的结果表明，99.8%的污染背景蛋白得到去

　　除。A280 蛋白分析表明污染蛋白主要集中在馏分 11-30，并可与包

　　含 EVs 的馏分有效区分。通过 Anita Böing(学术医学中心，阿姆斯

　　特丹，荷兰)基于 qEV 尺寸排阻柱的分离研究表明，馏分 7-9 中包

　　含丰富的 CD61，该分子是血浆 EVs 中的标志物(图 3)

　　结论

　　qEV 尺寸排阻柱是目前血浆 EVs 分离中最快速最方便的方法。与其

　　他方法不同，qEV 尺寸排阻柱与 EVs 的作用比较温和，除去污染蛋

　　白、囊泡聚集体和高密度脂蛋白的同时能够保持 EVs 的生物学特性。

　　此外，实验中无需使用其他添加剂，因此适合于下游的分析，如蛋

　　白质组学分析，免疫印迹，ELISA，电镜分析和 RNA 分析。对于需要

　　最高纯度 EVs 的实验，可以合并馏分 7-9。对于需要最高 EVs 产率的

　　实验，可以合并馏分 7-11。qEV 尺寸排阻柱具备高效、可直接使用

　　等特点，其过硬的质量可以保证您的研究，无需将过多的时间和精

　　力放在 EVs 的分离。

　　*若获得的 PFP 当天不用于 EVs 的分离，可将分装样品保存于-80°C

　　待用。取用时，将 PFP 于室温下解冻并离心(10,000 g, 10 min)以

　　去除冻融产生的聚集体。