组蛋白H3兔抗体研究方案——实例展示

组蛋白3（H3）位于细胞核内，与染色质结合。与H2A、H2B和H4一起存在于核小体中。

一起来看一下下面的3组应用实例：

1.2μg拟南芥染色质富集部分（1）和4周龄拟南芥叶片（2）中的3.75μg总蛋白，在12%SDS-PAGE上分离并在Immobilon-P（微孔，半干）PVDF膜上印迹50分钟。在室温下搅拌转移至MTBS-T（5%牛奶）30分钟后，立即阻断印迹。在室温下搅拌，将印迹在1:5000稀释的一级抗体中培养1小时。倾析抗体溶液，短暂冲洗印迹两次，然后在室温下搅拌在TBS-T中洗涤3次，持续3分钟。在二级抗体（抗IgG辣根过氧化物酶结合物，来自Agrisera，AS09 602）中培养印迹，在室温下搅拌稀释至1:20 000 30分钟。按照上述方法清洗印迹，并按照制造商的说明用ECL检测试剂显影5分钟。曝光时间为30秒。在肽中和试验中，用于诱导H3抗体的肽在染色质富集部分（1）中的双带已被超越。染色质izolation如前所述（Zilberman et al.2008）进行，并进行了少量修改。

用15%SDS-PAGE分离30μg 5µl饱和8M尿素中的衣原体Reinharddi蛋白，并用湿转移系统在100V下印迹1h至0.2µm硝化纤维素。用0.5%冷鱼胶在室温下搅拌，将斑点封闭1h。将印迹在原代抗体（抗H3）中，稀释1:2500，在RT下搅拌1小时。用3X 15min TBS-TT在RT搅拌下清洗斑点。在第二抗体（日光800）1:5000稀释中孵育30min，搅拌30min，用TBSTT冲洗1X 15min，1X与TBST一起清洗15min，然后用ODyssey IRD扫描仪扫描。

根据前面描述的方法进行免疫细胞化学分析（Rybaczek和Maszewski 2006）。将蚕豆根尖部分（1.5mm长）在PBS缓冲液（3.7%多聚甲醛）中固定45 min（18℃），用PBS洗涤数次，置于柠檬酸缓冲消化液（pH 5.0；37℃45分钟），含2.5%果胶酶（Fluka），2.5%纤维素酶（Onozuka R-10；Serva）和2.5%果胶酶（ICN）。去除消化液后，在PBS中清洗根尖3次，用蒸馏水冲洗，并压碎在Super Frost Plus玻片上（Menzel Gläser）。将风干载玻片用PBS缓冲5%BSA在20℃下预处理50分钟，并在加湿空气（4℃）中与针对H3组蛋白（Agrisera）培养的兔抗体一起培养过夜，将其溶解在含有1%BSA的PBS中（以1:50的稀释度）。孵育后，用PBS洗涤载玻片3次，并用Agrisera二级山羊抗兔IgG DyLight®488抗体（AS09 633，1:1000）孵育1h（18℃）。核DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.4μg/ml）染色；西格玛-奥尔德里奇）。在用PBS洗涤后，将载玻片风干并嵌入Vectashield荧光安装介质中（Vector Laboratories）。使用配备有B-2A滤光片（蓝光；λ ≈ 495nm），用于DyLight共轭抗体和UV-2A滤光片（UV光；λ ≈ 365 nm）用于DAPI。所有的图像都是在完全相同的时间用dxm1200ccd相机记录下来的。

Agrisera公司提供1000种用于植物和藻类细胞生物学研究的一抗，2000多种二抗。Agrisera公司提供的植物领域的抗体涵盖拟南芥、莱茵衣藻、蓝藻、松柏类、硅藻、大豆、大麦、蒺藜苜蓿、烟草、稻、菜豆、小立碗藓、杨树、豌豆、番茄、马铃薯、菠菜、小麦、玉米、葡萄等多个物种。艾美捷科技是Agrisera的中国代理商，为您提供优质的组蛋白H3（兔抗体）。 

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