双尾RT-qPCR技术——多种样本miRNA的定量和检测

双尾RT-qPCR是什么呢？它是一种基于PCR法的miRNA定量检测试剂盒。那么，就先从传统microRNA PCR检测法的痛点说起吧~

传统的PCR法检测microRNA，两个常规PCR引物的总长度几乎是microRNA长度的两倍，因此不适合于做miRNA的引物。以前的技术通过使用发夹引物延伸microRNA，添加poly A尾巴或通过连接添加片段来解决这个问题，但是这会降低检测的灵敏度和特异性。此外，这些方法无法检测在3'末端修饰的microRNA，因为它会干扰延伸过程。

好了，说到这里，在郑重向大家介绍这款名为双尾RT-qPCR技术。它的原理如下：

与使用单个结合探针不同，双尾PCR使用两个半探针，它们分别结合到不同的microRNA片段上，这些片段通过折叠的系链连接。虽然每个半探针本身都很短, 无法结合到microRNA上，但当两个半探针互补时，它们会协同结合，这种结合的特异性是非常高的，因为在短半探针中错配的影响非常大。然后可以使用两个特定序列引物对形成的cDNA进行PCR扩增，用SYBR进行检测。

怎么样，有没有明白一点了，那么接下来，了解一下它的优势吧！

1.高灵敏度：最多少于10个分子；

2.高特异性

适合于多种样本（血浆/血清，血液，组织等）中的miRNA检测和定量

通过折叠的系链连接的两个半探针（结合不同的microRNA片段）

动态范围广（高达9 log）

在进行单重qPCR之前，可进行双管多重RT-PCR

提供定制化服务

高灵敏度及特异性：

1）5´互补片段显著提高分析的灵敏度：

2）5´ 互补片段显著提高检测的特异性：

适用样本类型丰富：

检测流程简便：

文章来源：超高灵敏度和特异性miRNA定量方法——双尾RT-qPCR

https://www.amyjet.com/featured/rt-qpcr-2.shtml

——————————————————————————————

真的有完整提取microRNA的科研工具吗？

MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用；在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越受科研人的关注，目前，满世界的科研工作者都在寻找一款可以完整提取microRNA的科研工具...

为什么？因为很多人，他们用的不管是Q/T品牌，还是国产品牌的microRNA提取试剂盒，效果都很一般，提取物里面要不是含有＞200nt的大分子量RNA，要不就是提取的microRNA浓度和纯度不达标，导致实验结果无法重复，毕业论文迟迟无法完成，延毕的事情也经常发生。

这种对microRNA产品线吐槽的声音，显然被市场听到了，那么提取完整的microRNAs，就势在必行，迫在眉睫。

来，我们一起来看看Nature同款方案？对的你没看错，Nature！同！款！方！案！

microRNA纯化试剂盒，适用样本：动物细胞，组织，细菌，血液，植物组织；特色：1）25分钟提取高质量和纯度的miRNA（< 200 nt）2）两柱体系：在第一纯化柱上消除大RNA，在第二根纯化柱上捕获microRNA；3）洗脱的microRNA可用于RT-qPCR, Microarrays, Northern Blotting以及NGS等应用.

Nature文章结果：DOI  10.1038/s41591-018-0230-4

同类研究工具横向对比：

从Hela细胞中提取microRNA

qPCR检测不同品牌的提取效果

基于miR-21和5S rRNA，Norgen提取效果

参考：

Cancer cells exploit an orphan RNA to drive metastatic progression.Nature Medicine.2018

Genomewide Association Study of African Children Identifies Association of SCHIP1 and PDE8A with Facial Size and Shape.PLOS One.2016

The human PMR1 endonuclease stimulates cell motility by down regulating miR-200 family microRNAs.Nucleic Acid Research.2016

Identification of MicroRNAs and Transcript Targets in Camelina sativa by Deep Sequencing and Computational Methods.PLoS ONE.2015

Bacterial recognition by TLR7 in the lysosomes of conventional dendritic cells.Nature Immunology.2009

文章来源：真的能提取完整microRNAs（< 200 nt）吗？

https://www.amyjet.com/featured/microrna-purification-kit.shtml