大肠杆菌表达宿主菌(穿刺菌/甘油菌)的订购、运输、复苏及长期保存

一、订购

赛尔瑞成提供多种大肠杆菌宿主菌，如需订购，可提供两种形式的宿主菌供您选择：穿刺菌和甘油菌，货期均是2-3天. 

穿刺菌制备方式：将菌种摇瓶活化（对数期），预先在1.5ml的EP管中加入半固体琼脂培养基，把活化过的菌种用牙签穿刺接种于半固体琼脂培养基中，37℃ 培养一个晚上即可。

甘油菌制备方式：将菌种摇瓶活化，培养至对数期，取适量菌液于小管中，加入终浓度为10%-20%的灭菌甘油，混匀后即可，直接置于-80℃保存。

二、运输及保存方式

穿刺菌的运输及保存方式：2-8℃运输，4℃冰箱保存一周。

甘油菌的运输及保存方式：低于0℃运输，-80℃冰箱长期保存，定期（1年）复壮。

三、复苏

1. 客户收到穿刺菌后该如何操作？

可先置于4℃保存，尽量不要超过两周。
1周内从穿刺菌管中挑菌于LB或2YT平板划线。然后挑取单菌落接种在LB或2YT液体培养基中，待菌液生长至对数期以后，即可取出一定体积的菌液，加入终浓度为10-20%的甘油，就得到了可长期保存的甘油菌种，可置于-80℃保存备用。

具体操作方法：
取一个灭菌过的移液器枪头或接种牙签，沿着穿刺管中乳白色的大肠杆菌菌体生长线插入，来回操作几次，每次都轻微改变枪头的方向，以尽可能的增加枪头与菌体的接触面。将沾了菌的枪头或牙签在LB或2YT平板上划线。将划线平板置于37℃培养箱中过夜培养以长出单菌落。次日从LB或2YT平板上挑取一个单菌落接种到LB或2YT液体培养基中，37℃摇床震荡培养，待菌液生长至对数期以后，即可取出一定体积的菌液，加入终浓度为10-20%的甘油，就得到了可长期保存的甘油菌种，可置于-80℃保存备用。剩余菌液可继续用于实验工作。
注：建议挑取两个以上单菌落制备长期保存的菌种。

2. 客户收到甘油菌后该如何操作？

直接置于-80℃冰箱长期保存，也可分装成小份保存。使用之前拿出解冻，摇瓶复苏菌种即可。

具体操作方法：
常温解冻甘油菌（部分解冻即可），取一个灭菌过的移液器枪头或接种牙签，蘸取甘油菌，在LB或2YT平板上划线。将平板置于37℃培养箱中过夜培养以长出单菌落。次日从LB或2YT平板上挑取一个单菌落接种到LB或2YT液体培养基中，37℃摇床震荡培养，即可开展后续实验工作。
注：建议挑取两个以上单菌落制备长期保存的菌种。

四、注意事项

1. 无论从穿刺菌还是甘油菌制备菌种，都建议先在LB或2YT平板上划线，然后挑取一个新鲜的单菌落于液体培养基中震荡培养。这是为了避免偶然情况下正常菌落中隐藏的突变细菌或杂菌。如果您只是简单的从混合菌落中挑选了一团细菌，然后在液体培养基中培养，某些情况下突变的细菌有可能会接管整个培养物成为优势菌种，从而影响您的实验。而每个单独的菌落就是单克隆，即它们在遗传学上是相同的因此通过划线挑取单克隆的方法可以很好的避免这种问题。

2. 在制备长期保存的菌种时，建议挑取两个以上单菌落制备菌种。

3. 液体菌种制备好以后，应直接置于-70℃以下保存，而不要在-20℃或其它温度保存，否则菌种保存期会明显缩短。

4. 有些菌种本身有抗性，或者含有载体的菌种，则需用含有相应抗生素的LB或2YT平板或液体培养基培养，这样保证偶然掺入的杂菌得到抑制。

附：抗生素使用终浓度
氨苄青霉素(Ampicillin)：100 μg/ml
卡那霉素(Kanamycin)：10-50 μg/ml
氯霉素(Chloramphenicol)：17-34 μg/ml
四环素(Tetracycline)：5-12.5 μg/ml
链霉素(Streptomycin)：50 μg/ml
(根据质粒拷贝数的高低，抗生素使用浓度可以适当调整)

赛尔瑞成可提供的大肠杆菌宿主菌列表