修改说明书使用MOBIO试剂盒提取新鲜组织或FFPE样品的microRNA

我们从之前的文章中已经知道了如何使用我们的离心柱型试剂盒快速简便地从组织中提取RNA 。

但我们还是经常被问到组织样品microRNA（miRNA）的提取。MicroRNAs是长度约为22个核苷酸的小分子RNA，通过结合到mRNA 3’端非编码区，通常在蛋白翻译水平上抑制基因表达。在基因表达调整上起重要作用。每个miRNA可以抑制上百个靶mRNAs（1），miRNAs的错误表达常与疾病相关。正因为它们对基因表达的重要调控作用，目前miRNA研究主要方向集中在癌症治疗上（2）。

miRNA提取并没有那么复杂

miRNAs的小片段特性意味着需要调整试剂配方，增强硅胶离心柱对小片段的吸附绑定。目前的配是方针对信使RNA的，丢弃了tRNA和小片段RNAs，对检测低拷贝数的转录本带来相当难度。因为5s和tRNA占总RNA 20%之多，丢弃前者相当于富集了信使RNA， 幸运的是，捕捉小片段RNA并不难。硅胶吸附技术中，影响滤膜绑定效果的有两个因素：胍酸盐和乙醇浓度。通过修改绑定步骤中乙醇的浓度，我们可以吸附绑定大多数小片段RNA，而通常情况下它们会被冲洗掉。主要稍微简单修改就能解决问题，何必多花钱另外买一个试剂盒呢？

提取步骤

以下是使用UltraClean Tissue & Cells RNA Isolation Kit同时回收mRNA和miRNA的操作步骤：

1、按照原说明书均质化样品，冲洗裂解物。 2、加入1.5倍体积的100%乙醇到裂解物中。 3、接着步骤继续。

非常简单，若Solution TR1（裂解缓冲液）在开始加了300μl，100% 乙醇用450μl。若Solution TR1加了600μl，100% 乙醇加900μl。

正常情况下这步加入70%乙醇到裂解物中，乙醇的浓度使得mRNA和tRNA都被吸附绑定，小片段RNA（＜200碱基)将被冲洗掉。你要找转录本，这么做就可以了。但如果你要做的是降解了的RNA，希望捕捉所有小片段RNA或miRNA，增加乙醇浓度就行。

从FFPE组织提取RNA

在谈到降解RNA的时候，我想到了另一个话题，那就是从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中提取RNA，FFPE样品中的RNA大多是小片段的。如果你要用试剂盒来提，你要用高浓度的酒精来绑定RNA。

通过改动四个主要步骤，你也可以用UltraClean FFPE Tissue DNA Isolation Kit提取FFPE组织RNA。

首先是为了提RNA而选用的另一种消化用裂解缓冲液。这个新的裂解缓冲液可以在加热消化组织、去除蛋白交联的过程中保护RNA（无需去除石蜡）， 用于去蛋白交联的水浴温度调整为70℃，时间为30min（替代DNA的90℃ 1个小时）（3）。

乙醇与裂解物的体积比增加到2：1，以在盐环境下把所有RNA都绑定在滤膜上。

最后，在洗脱前用on-spin Column DNase Kit去除离心柱滤膜上的基因组DNA。

FFPE DNA Kit的其它组分都是一样的。

总结

有那么多适用于RNA的试剂盒，现在很难去对比操作步骤，哪个更合适。方法并没有那么复杂，所以如果一个试剂盒就能解决问题，为什么要买两个试剂盒来提一个RNA呢？化学试剂的成分都是一样的，为什么为了miRNA，要付出比提总RNA更多的钱呢？

如果你在研究miRNA，尝试中有任何问题，请随时联系我们。

参考文献：

1. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P., Grimson, A., Schelter, J. M., Castle, J., Bartel, D. P., Linsley, P. S., and Johnson, J. M. (2005). Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433, 769-773.

2. Li, C; Feng, Y; Coukos, G; Zhang, L (2009). "Therapeutic microRNA strategies in human cancer". The AAPS journal 11 (4): 747–57

3. Norikazu Masuda, Tadashi Ohnishi, Shoko Kawamoto, Morito Monden, and Kousaku Okubo (Nov 1999). Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res., Nov 1999; 27: 4436 – 4443.