麦克林蛋白酶K产品介绍

       蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH范围（4~12.5)内及高温(50~70°C)均有活性，用于质粒或基因组DNA、RNA的分离。在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，随后用不同方法进行抽提，除去杂质，收集DNA。EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。

蛋白酶K三维结构

本文通过以下几点详细阐述蛋白酶K的作用机理及应用范围：

1.特异性

2.生理性质及动力学

3.抑制器

4.应用范围

5.溶解性和溶液稳定性

特异性

蛋白酶K具有广泛的底物特异性。即便存在洗涤剂的情况下，其仍可降解许多非变性状态的蛋白质。蛋白酶K分离自一种可在角质上生长的真菌白色侧齿霉菌(Engyodontium album)（前称腐生真菌(Tritirachium album)。因此，蛋白酶K能够降解非变性状态的角质（头发），因而称为“蛋白酶K”。其切割的主要位点为带有封闭氨基基团、邻近脂族或芳香族氨基酸羧基端的肽键。因其广泛的特异性，其较为常用。

生理性质

蛋白酶K是稳定的S8家族丝氨酸碱性蛋白酶，在邻近活性位点组氨酸的位置含有两个二硫键和一个游离半胱氨酸。

分子量：28,930 Da （氨基酸序列）；28,500 Da (SDS-PAGE)

pH范围：7.5-12.0（尿素变性后的血红素为底物），但多数情况下使用的pH范围为7.5-9.0。

温度曲线：最适活性温度37 °C（20至60 °C之间活性>最大活性的80%）

pI: 8.9

消光系数：E1% = 14.2 (280 nm，10 mM NaCl和5 mM CaCl2，pH 8.0)

活化剂：活化需要1-5 mM Ca2+。去除酶中的钙离子（加入EDTA）后，会丢失25%的催化活性。但如果通过凝胶过滤去除EDTA-Ca2+复合物，则会总计丢失80%的酶活性，仅在向不含Ca2+的酶中加入过量的Ca2+时，才会发生少量活化。

蛋白酶K在1% TRITON™ X-100之中激活，并在0.5% (w/v) SDS之中完全激活。SDS和尿素会使蛋白质底物变性，提高消解速率。在这些试剂作用下，蛋白酶K自身的消解速率要慢得多。

单位定义：在pH 7.5、37 °C下，每分钟可水解尿素变性的血红素，产生1.0 mmole (181 mg) 酪氨酸所需的酶量为一单位。

抑制剂

蛋白酶K的抑制剂为DIFP或PMSF（后者使用的终浓度为5 mM）。EDTA（参见“活化剂”部分）只会使其部分失活，并不能起到抑制作用。蛋白酶K不会受到碘乙酸、胰蛋白酶特异性抑制剂TLCK、糜胰蛋白酶特异性抑制剂TPCK以及对-氯汞基苯甲酸盐抑制。

应用

1.线粒体分离

2.核酸纯化产物的蛋白质消解。在分子生物学应用中，蛋白酶K常用于消解无用的蛋白质，例如从微生物、培养细胞和植物的DNA或RNA制剂中消解核酸酶。在核酸制剂之中，这种酶的使用浓度通常为50-200 μg/ml，pH 7.5-8.0，37 °C。孵育时间30分钟至18小时不等。尽管在长期孵育时，蛋白酶K可以自动消解，但通常还是通过后续的本分萃取法使其变性。

3.蛋白酶K已经用于去除阳离子蛋白质上结合的内毒素，如溶菌酶和核糖核酸酶A上的内毒素。

4.确定酶在膜上的分布

5.处理石蜡包埋的组织，以便暴露抗原结合位点进行抗体标记

6.去除核酸酶进行原位杂交

7.传染性海绵状脑病(TSE)朊病毒研究及草拟的诊断测试方法利用蛋白酶K消解来自大脑组织样本的蛋白质。

8.采用蛋白酶K消解法进行蛋白酶足迹实验，去除蛋白质-蛋白质表面互作。

制备说明

蛋白酶K可溶于水(1 mg/ml)，获得无色透明的溶液。

溶解性和溶液稳定性

建议在–20 °C下冻存粉末。产品可稳定保持至少2年。

蛋白酶K溶液在较广的pH范围内（4.0-12.5，最适pH 8.0）保持稳定，同时在使用时可在25-65 °C范围内保持稳定。pH 8.0时，溶液至少可在4 °C下稳定保存12个月。3 pH 4-11.5时，含有Ca2+ (1-6 mM)的溶液预计可稳定保存数周。80%的硫酸铵悬液可在4 °C下至少稳定保存12个月。

麦克林Macklin蛋白酶K产品

麦克林是蛋白酶K大规模生产商。我们针对诊断生产和生物技术客户提供了定制配方制剂。访问麦克林官网：www.macklin.cn 了解更多产品信息