HPLC分离测定氨苄西林及其降解产物

摘　要：

目的：建立新的HPLC分离测定氨苄西林及其降解产物的方法。方法：色谱条件为：Nova-Pak C18色谱柱；0.02mol.L-1磷酸二氢钠溶液(pH4.5)-乙腈(95∶5)为流动相；检测波长为230 nm。

结果：在0.24～1.20mg.ml-1的浓度范围内线性关系良好，r=0.9991，平均回收率为100.6%(n=5)，RSD＝0.47%，重复进样RSD＝0.06%(n=5)，氨苄西林及其降解产物得到基线分离。

结论：本法简便、快速、准确，适用于氨苄西林的含量测定及其降解产物的检查。



　　氨苄西林(氨苄青霉素)为β-内酰胺类抗生素，对革兰阳性、阴性菌有较强的抑制作用，临床应用较广。中国药典1995年版二部、美国药典ⅩⅩⅢ版、英国药典1993年版均有收载，其质量控制方法相应为硫醇汞盐紫外分光光度法，HPLC，电位滴定法。分光法、电位法，操作繁琐，分析周期长，专属性不够好，且汞盐毒性较大。本文采用HPLC分离测定了氨苄西林及其降解产物，结果满意。

1　仪器与试药

　　日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6N紫外-可见检测器，C-R4A色谱数据处理机。
氨苄青霉素三水物(氨苄西林)对照品(批号410-9402，含量85.6%，中国药品生物制品检定所)；注射用氨苄西林钠(批号961210，961248，970302，石家庄市第二制药厂)；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为重蒸馏水。

2　方法与结果

2.1　色谱条件

　　色谱柱：大连化学物理研究所Nova-Pak C18(4.6 mm×200 mm,4 μm)；流动相：0.02mol。L-1磷酸二氢钠溶液(pH4.5)-乙腈(95∶5)，薄膜(0.5 μm)过滤并脱气；检测波长为230 nm；流速：1.3ml。min-1；灵敏度：0.08 AUFS；进样量：20 μl。

2.2　系统适用性试验

　　碱性降解产物的制备：称取氨苄西林对照品，用0.01 mol。L-1氢氧化钠溶液制成0.6 mg。ml-1溶液，放置30min，然后用磷酸调节溶液pH值至(4.5±0.1)，量取5 ml置25 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
取上述溶液20 μl注入色谱仪，在上述色谱条件下分离，得色谱图(图1)，从图中可见，氨苄西林峰的保留时间约为12min，氨苄西林与降解产物实现基线分离。理论塔板数以氨苄西林峰计为2700，氨苄西林峰与相邻降解产物峰的分离度为7。

2.3　线性关系

　　精密称取氨苄西林对照品适量，用流动相制成2.4 mg。ml-1溶液，精密量取1，2，3，4，5 ml分别置10ml量瓶中，用流动相定容，摇匀。在上述色谱条件下各进样20 μl测定。结果氨苄西林在0.24～1.20mg。ml-1的浓度范围内峰面积(A)与浓度(c,mg。ml-1)线性关系良好，回收方程为：A=201690c+5050,r=0.9991。

2.4　精密度试验

　　取氨苄西林对照品，用流动相制成0.6mg。ml-1溶液，在上述色谱条件下重复进样5次，峰面积的RSD为0.06%，精密度良好。




2.5　重现性试验

　　精密称取同一批号样品5份，按样品测定方法操作。结果RSD为0.40%。

2.6　回收率试验

　　精密称取已准确测定含量的注射用氨苄西林钠，准确加入适量氨苄西林对照品，用流动相溶解，按样品测定项下方法测定，结果见表1。
表1　回收率测定结果.n=5


加入量/mg 测定量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
11.81 11.93 101.00
11.95 12.01 100.50 100.60 0.47
12.01 11.99 　99.80
12.12 12.19 100.60
12.24 12.35 100.90

2.7　样品测定
　　精密称取注射用氨苄西林钠样品3批各适量，分别用流动相稀释成0.6mg。ml-1溶液，在上述色谱条件下进样测定。另精密称取氨苄西林对照品适量，同法稀释测定。以外标法计算含量，面积归一化法检查降解产物，结果见表2。

表2　样品测定结果.n=3


批号 含量/% RSD/% 降解产物/%
961210 86.97 0.18 0.79
961248 86.28 0.15 0.84
970302 87.09 0.11 0.77

3　讨　论
3.1　考察了流动相中乙腈量对氨苄西林保留时间的影响。乙腈量减少，保留时间延长，以5%配比，保留时间较合适。
3.2　考察了流动相中，磷酸盐缓冲液不同的pH值(5.0，4.5，4.0)对保留时间的影响。缓冲液的pH值调至4.5与5.0时，保留时间大致相同。pH值调至4.0时，保留时间明显延长。
3.3　配好的样品溶液在室温放置5 h后再测定，结果几乎不变，溶液稳定性良好。
3.4　取氨苄西林对照品用流动相制成95.7 μg。ml-1溶液，于岛津UV-265FW型紫外分光光度计在200～400nm波长范围内扫描，在波长208 nm处有最大吸收，但此处为末端吸收，干扰较大。选择230nm波长处测定，灵敏度适中，干扰小。
3.5　由于定量管进样的广泛采用和仪器性能的不断提高，HPLC精度很高，目前新药标准中普遍采用外标法定量，本实验的精密度试验很好，因此以外标法计算含量。
3.6　氨苄西林在碱性条件下遇湿不稳定，样品中存在部分降解产物。本文所述的色谱条件，可使氨苄西林及其降产物得到基线分离，方法专属性较高。本法简便、快速、准确，适合控制氨苄西林的质量．