高效液相色谱法的建立

高效液相色谱法HPLC是近年来发展最快的一门新的分析分离技术，正越来越多地用于质量检验、实验研究和制备分离，已成为化学和生物化学不可缺少的高效、快速、灵敏的分析分离手段。   步骤一：　　我们应了解样品成分和性质。包括：１．所含化合物的数目２．化合物的化学结构（官能团）３．化合物的分子量４．化合物的pKa值５．化合物的UV光谱图６．样品基质的性质：溶剂，填充物等７．化合物在有关样品中的浓度范围８．样品的溶解度９．是否是手性化合物   步骤二：　　　样品的预处理：１．可直接进样的溶液２．需稀释、缓冲pH或添加另一液体３．能在流动相中溶解的固体４．含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液５．含有不溶性赋形剂的混合物   主要HPLC方法的特性反相HPLC: 流动相：水/有机溶剂色谱柱：C-18(ODS),C-8,苯基，三甲基硅烷(TMS),氰基 应用范围：首选为能溶于水/有机混合液的中性或非离子化合物   正相HPLC：流动相：有机溶剂混合液色谱相：氰基，二醇基，氨基，硅胶应用范围：当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好的选择；首选为不溶于水/有机溶剂混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC（硅胶最好）   离子对HPLC: 液动相：水/有机溶剂　　　　一种缓冲物控制pH，和离子对试剂色谱柱：C-18,C-8,氰基应用范围：为离子或可电离化合物，尤其碱性或阳离子化合物的良好选择。   建立HPLC方法的目的：１．分离度：精密度和抗干扰的定量分析需Rs>1.5 ２．分离时间：<5-10min时日常工作较理想３．定量：含量测定；<=２％（１SD）；要求不高的或痕量分析：５％４．压力：最好<150bar;<200bar通常是基本的（假设为新柱）５．峰高：最好为信噪比在的窄峰６．溶剂消耗：每个样尽量少消耗流动相   保证良好柱寿命的步骤：１．用填充良好的柱２．尽量减小压力波动；避免机械及热冲击３．用保护柱和在线滤片４．经常用强溶剂冲洗柱子５．预处理“脏样品”，以尽量减少无用的强滞留成份和微粒６．用稳定的固定相７．用低于60度的柱温８．硅胶基质柱要保持流动相pH在3-7之间；如超出此限制操作是，须安装预柱９．在水溶液流动相或缓冲液中加100ppm的叠氮化钠１０．过夜和贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，以纯乙腈保存柱，避免高浓度的水和醇类。   色谱常用符号与术语： ACN:乙腈 RRT:相对保留时间 F:响应因子 MTBE:甲基叔丁醚 pKa：溶质酸性常数的负对数；当pH=pKa时，溶质中有一半是电离的 ODS:十八烷基硅烷Octadecylsilyl BDS:碱纯化硅胶 Base deactive silica TEA:三乙胺 TBA:四丁基铵离子 THF:四氢呋喃 TLC:薄层色谱法Thin layer chromatography TMS:三甲基硅烷   以上为《实用高效液相色谱法的建立》摘抄部分。