细胞衰老改变猪小梁细胞对剪切应力的响应

青光眼通常分为几种类型，其中原发性开角型青光眼（POAG）是最常见的一种。尽管对青光眼发病机制知之甚少，但由于小梁网（TM）处的细胞外基质沉积导致对房水流出的抵抗增加，可能导致眼内压（IOP）升高，这被认为是POAG的主要危险因素之一。TM位于前房角的角巩膜缘区，是一种机械敏感组织，是房水流出眼球外的主要通道。尽管潜在的机制仍然难以捉摸，但据报道，细胞外信号调节激酶（ERK）通路参与调节TM中基质金属蛋白酶（MMPs）的产生。研究表明，ERK通路可以影响人眼小梁细胞（TMCs）中MMPs的分泌，这可能导致ECM的异常积累，从而导致眼压升高，最终发展为青光眼。

由IOP驱动的房水的大量流动对常规的流出通道施加了剪切应力。预计该剪切应力在2-25 dyn/cm2 的范围内，由于青光眼患者的眼压升高，该值可能更高。现有研究表明，TMC可以响应房水流施加的剪切应力，从而提供了一种调节反馈手段来控制眼压。

患POAG的风险明显随着年龄的增长而增加。TMCs的衰老被认为是POAG发生或进展的主要危险因素。大量研究表明，细胞衰老可以改变 TMCs 的形态、细胞骨架、表型和功能的。然而，细胞衰老如何影响TMCs对剪切应力的反应却鲜为人知。

在这里，生物力学与力生物学教育部重点实验室、国家纳米科学中心、中国科学院力学研究所的一项联合研究探讨了衰老对猪眼小梁（PTM）细胞对剪切应力反应的影响，研究结果表明，细胞衰老损害了PTM细胞对剪切应力的生理反应。

高氧诱导的细胞衰老模型

在这项研究中，研究人员采用了高压氧治疗来诱导衰老细胞。结果发现，与正常PTM形态 相比（图1 A），这些细胞在40% O2中的生长表现出扩大的细胞形态（图1 B）。暴露于高氧 2 周后，PTM 细胞的细胞衰老标志物 β-半乳糖苷酶呈阳性（图1 D），而对照PTM细胞的染色可以忽略不计（图1 C），如图1 E所示。此外，流式细胞术结果显示，与对照组相比（图1 G），暴露于高氧后，G2/M 期细胞的比例似乎在减少（图1H）。定量结果显示在图1 F。

图1   高氧作为猪小梁网（PTM）细胞衰老的实验模型。

在对照（A）或高氧（40% O2）条件（B）下PTM细胞生长2周的形态。在对照（C）或高氧（40% O2）条件（D）下生长2周的PTM细胞β-半乳糖苷酶染色。在对照条件下生长的PTM细胞对衰老标志物β-半乳糖苷酶的染色可以忽略不计，而暴露于高氧的细胞对该标志物染色呈阳性（E）。与对照组相比，高氧暴露后S期和G2期的细胞比例下降（F）。流式细胞术定量PTM细胞在对照（G）或高氧（40% O2）条件（H）下生长2周的细胞周期。

衰老对PTM细胞细胞骨架和细胞刚度响应剪切应力的影响

PTM细胞的量化排列被描述为相对于流轴 ±30° 范围内的细胞比例。对于正常的PTM细胞，如图2 A、B，暴露于25 dyn/cm2的剪切应力12小时后，与静态组相比（无剪切应力），与流向轴（0°）方向角在 -30°至30° 之间的细胞比例明显增加。相比之下，对于衰老的PTM细胞，与静态组相比，暴露于剪切应力后，细胞的百分比没有显著变化（图2 A、B）。这些结果表明，在暴露于25 dyn/cm2的剪切应力12小时内，正常的PTM细胞倾向于向流动方向定向运动，而衰老的PTM细胞则没有以相同的方式响应。

如图2 C，与正常PTM细胞相比，这些衰老PTM细胞的F-肌动蛋白含量显著增加。当细胞暴露于剪切应力时，正常和衰老PTM细胞中的F-肌动蛋白含量均显著提高。相应地，原子力显微镜（AFM）结果表明，PTM细胞的衰老导致细胞刚度增加（图2 D）。在受到剪切应力后，正常和衰老的PTM细胞都表现出增加的细胞刚度。实验定量地观察到，正常和衰老PTM细胞在暴露于剪切应力后，刚度分别增加了67.44% 和 36.14%。正如预期的那样，同时将 PTM 细胞暴露于高氧和剪切应力下，与对照组相比，细胞刚度发生了最显著的变化（图2 D）。这些结果表明，细胞刚度与F-肌动蛋白含量呈正相关。

图2   衰老对PTM细胞细胞骨架和细胞刚度响应剪切应力的影响。

（A）在静态条件（无剪切应力）或承受 25 dyn/cm2 剪切应力下正常和衰老 PTM 细胞的荧光图像。（B）正常和衰老PTM细胞在静态条件下或承受剪切应力的细胞骨架排列。（C）正常和衰老PTM细胞在静态条件下或承受剪切应力的F-肌动蛋白含量。（D）正常和衰老PTM细胞在静态条件下或承受剪切应力的细胞刚度。

衰老对PTM细胞响应剪切应力下的细胞迁移的影响

进行Transwell测定以确定承受剪切应力的正常和衰老PTM细胞的迁移能力。结果发现，与正常PTM细胞相比，衰老PTM细胞的迁移速率显著降低。在剪切应力下暴露12 h后，正常PTM细胞的迁移能力比静态组显著提高。然而，对于衰老的PTM细胞则相反。

衰老对PTM细胞响应剪切应力下的MMP、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）和胶原mRNA表达的影响

RT-PCR结果表明，与静态组相比，正常的PTM细胞暴露于剪切应力12 h后，MMP-1，MMP-2，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达显著上调。然而在衰老的PTM细胞中，除TIMP-1外，这些特定蛋白的mRNA表达均显著下调。此外，在暴露于剪切应力后，正常和衰老PTM细胞中I型胶原（COLA-1）和IV型胶原（COLA-4）的mRNA表达均未发生变化。

衰老对PTM细胞响应剪切应力下ERK蛋白表达的影响

最后，实验还使用蛋白质印迹分析研究了ERK的表达和磷酸化。对于正常的PTM细胞，与静态组相比，暴露于剪切应力12小时后p-ERK /总ERK比值显著增加。相比之下，观察到暴露于剪切应力12小时后衰老PTM细胞的p-ERK /总ERK比率显著降低（图3 A、B）。为了进一步研究衰老对ERK表达和磷酸化的影响，实验通过应用短期剪切应力，研究了正常和衰老PTM细胞的剪切应力暴露时间依赖性。如图3 C、D，对于正常的PTM细胞，与静态组相比，暴露于剪切应力10分钟和30分钟后，p-ERK /总ERK比值大致保持不变。然而，对于衰老的PTM细胞，p-ERK/总ERK比值显著下降到剪应力暴露后12 h的值，甚至是10分钟（图3 C、D）。这些结果表明，在正常或衰老的PTM细胞中，ERK磷酸化响应剪切应力的改变发生在不同的时间点。

图3    衰老对PTM细胞响应剪切应力下的细胞外信号调节激酶（ERK）和p-ERK表达的影响。

（A、B）在静态条件下或承受12小时剪切应力下正常和衰老PTM细胞的p-ERK和ERK表达的蛋白质印迹分析。（C、D）在静态条件下或经受 10 分钟和 30 分钟剪切应力下正常和衰老 PTM 细胞的 p-ERK/总ERK 蛋白表达的蛋白质印迹分析。

综上所述，pTMCs可以通过改变生物力学特性和生理功能来感知和响应剪切应力。然而，细胞衰老改变了机械生物学反应，并且在大多数情况下，使细胞对剪切应力的反应降低，这可能导致细胞TM功能随着年龄的增长而逐渐衰竭。尽管TMCs的机械生物学很重要，但我们对TMCs在青光眼或衰老中的机械应力反应行为的了解非常有限。这项研究为衰老通过影响TMC功能障碍在调节眼压中的作用提供了新的线索，这将加深对POAG病理生理学的理解。

参考文献：Du R, Li D, Zhu M, Zheng L, Ren K, Han D, Li L, Ji J, Fan Y. Cell senescence alters responses of porcine trabecular meshwork cells to shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 21;10:1083130. doi: 10.3389/fcell.2022.1083130. PMID: 36478743; PMCID: PMC9721263.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36478743/

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