文章标题：Transcriptome Analysis Revealed the Mechanism of Inhibition of Saprophytic Growth of Sparassis latifolia by Excessive Oxalic Acid

发表期刊：cells

影响因子：6.0

技术平台：转录组测序，qRT-PCR

广叶绣球菌(Sparassis latifolia)是一种价值极高的食用菌，具有丰富的活性成分和药理作用，是一种重要的药用和食品资源。广叶绣球菌是亚洲广泛种植和消费的商业蘑菇，但菌丝生长速度慢严重制约了其栽培规模的扩大。对底物的利用是直接了解菌丝生长的关键，以往研究发现其菌丝在生长过程中分泌大量草酸(Oxalic acid, OA)，草酸可以抑制菌丝生长。然而，在腐生植物生长过程中，对草酸生长速率的机制尚未深入阐明。目前还没有研究人员着重研究广叶绣球菌腐生生长缓慢的原因以及草酸对其菌丝生长缓慢的抑制作用。本研究利用illumina测序技术检测了不同草酸浓度下广叶绣球菌菌丝生长速率的差异特性，为阐明腐生过程中菌丝生长缓慢的机制奠定了重要基础。

1. 不同草酸浓度下广叶绣球菌菌丝生长的研究

在不同草酸浓度的松木木屑培养基(Pine sawdust medium, PSM)中培养20 d后的广叶绣球菌菌丝表现出不同的生长特征。在高草酸浓度(10 mM)条件下，广叶绣球菌菌丝菌丝生长受到明显抑制，菌丝生长速率最低（图1 A-C）。在PSM培养基中添加三氟碘甲烷(3,3-difluorooxaloacetate, IOA)，菌丝生长速率显著提高，生长速率显著高于其他处理（图1 D）。这些结果进一步表明，过量的草酸会抑制广叶绣球菌菌丝的生长，通过抑制草酸的合成降低草酸浓度进而显著促进菌丝生长。

图1. 草酸对PSM培养基中广叶绣球菌菌丝体生长的影响

2. 差异基因筛选

本研究对两两间（对照组CK、草酸合成抑制组IOA和草酸添加组OA）的差异基因进行筛选，OA组与CK组筛选出4478个差异基因（上调2248个、下调2030个）， IOA组与CK组筛选出1331个差异基因（上调666个、下调665个），OA组与IOA组筛选出3397个差异基因（上调2105个、下调1892个)（图2 A、C-E）。利用差异基因绘制Venn图，筛选出3个比较组共同或特有的差异基因（图2 B），发现与OA相关的比对组中筛选到的差异基因最多，而在OA组中，广叶绣球菌菌丝的生长速率最低，说明这些差异基因可能在菌丝生长中起着至关重要的作用。综上所述，这些结果表明草酸浓度影响了许多基因的表达，这些基因可能与菌丝生长密切相关。

图2. CK、IOA和OA处理的差异表达分析

3. 差异基因功能分析

对筛选到的基因进行GO功能注释。OA与CK的比较中，4478个差异基因中富集了231个GO条目，包括56个分子功能(Molecular Function, MF)， 136个生物过程(Biological Process, BP)和39个细胞成分(Cellular Component, CC) （图3 A）。MF富集的主要条目有转录因子活性、电子转移活性、泛素结合、醇脱氢酶(NAD+)活性等条目。BP富集的主要条目为有氧呼吸、细胞对热的反应、线粒体ATP合成耦合电子传递、质子跨膜运输、三羧酸(TCA)循环等。CC富集的主要条目为膜的组成部分、线粒体内膜、呼吸链复合体等条目。IOA与CK的比较中，1331个差异基因中富集了117个GO条目，包括47个MF, 55个BP和15个CC(图3B)。OA与IOA比较中，从3397个差异基因中富集了200个GO条目，包括43个MF, 139个BP和18个CC（图3 C）。

图3. 3种处理菌丝中差异基因的GO富集结果

对OA与CK、IOA与CK、OA与IOA这些比较筛选到的差异基因进行KEGG通路富集分析（图4 A），发现受草酸浓度影响的差异基因富集的KEGG通路类别为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和有机系统类别（图4 B-D）。同时展示3个比较组前30条富集的KEGG通路，在不同的对照组中，这些通路中含有受高浓度草酸影响的显著下调的差异基因（图5）。高草酸浓度对代谢类通路影响最大，特别是对氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢、外源生物降解代谢、糖类生物合成代谢和能量代谢的影响比较大。此外，许多参与环境信息加工的信号转导通路基因也被广泛抑制。因此，这些代谢途径极有可能与广叶绣球菌菌丝的生长有关。本研究筛选到编码木质纤维素降解酶的差异基因，包括内切-β-1,4-木聚糖酶(mRNA_2483)、外切-葡聚糖酶(mRNA_8946)、外切-β-1,3-葡萄糖苷酶(mRNA_6544)等，与IOA组相比，CK和OA组这些编码基因的表达水平显著下调。

图4. KEGG通路分类富集分析

图5. 不同比较组中TOP30 KEGG通路结果

4. 转录组数据的qRT-PCR验证

随机选择3个上调和3个下调的差异基因，验证转录组数据的相对表达水平。由结果可看出3个比较中，qRT-PCR基因表达水平与转录组数据显著一致，说明转录组数据准确可靠。

图6. qRT-PCR验证结果

本研究报道了不同草酸浓度诱导的广叶绣球菌转录组应答。通过三组比较，共鉴定出9206个差异表达基因，其中4587个基因下调，5109个基因上调。对差异基因的功能分析发现，过量草酸使与碳水化合物利用途径、能量代谢、氨基酸代谢、蛋白质合成代谢、聚糖生物合成和信号转导途径相关基因的表达量下调。此外，在过量草酸处理的菌丝体中，编码木材降解酶的基因显著下调。本研究结果为过量草酸抑制腐生植物生长提供了一种推测机制，为进一步研究广叶绣球菌菌丝生长奠定了基础。